miRNA实验技术及与肿瘤关系研究进展

miRNA实验技术及与肿瘤关系研究进展TheResearchProgressofmiRNAexperimentaltechniqueandcarcinoma摘要miRNA是一类新近发现的内源性非蛋白编码的单链小分子RNA，长度约为20-25nt，广泛存在于真核生物中。在人类已发现的300多个miRNA中有许多与肿瘤的发生有着密切的关系，研究人员通过实验手段和生物信息学方法研究了一些miRNA与肿瘤的关系，以期望寻找到治疗肿瘤的新方法。关键词：miRNA；肿瘤；miRNA抑制；miRNA过表达；生物信息学1.miRNA概述miRNA是一类新近发现的内源性非蛋白编码的单链小分子RNA，长度约为20-25nt，广泛存在于真核生物中，进化上相对保守，具有时序性和组织特异性。1993年Lee等[1]在对秀丽新小杆线虫（C-elegans）进行突变体的遗传分析中首次发现非编码蛋白质能时序调控其胚胎后期发育基因表达的RNA：Lin-4。2000年Reinhart[2]在线虫中发现了另一种重要的具有转录后调节作用的miRNA：let-7,从而拉开了miRNA的研究序幕。成熟的miRNA在5’端有-HP04基团，3’端具有-OH基团，二者可以和上游或下游的序列不完全配对形成茎环结构，其转录独立于其他基因，本身不具有开放阅读框架，不编码任何蛋白质。miRNA通常是由RNA聚合酶Ⅱ转录，最初产物为前miRNA(pri-miRNA)的大前体分子，在胞核内被处理成约70个核苷酸的前miRNA(pre-miRNA)，输送到胞质后被剪切产生22—25个核苷酸的双链miRNA，双链miRNA很快被整合到miRNA诱导的沉默复合体中，其中一条miRNA链被解旋酶所降解，另一条成熟miRNA以单链形式存在，保留下来的miRNA具有调节基因表达的功能。但现在有研究发现两条miRNA均有可能保留下来，但作用点有区别[3]。就目前研究成果所知的miRNA作用机理主要是指miRNA的2-8nt的序列可与靶基因3’UTR序列配对，从而抑制基因的表达，影响蛋白表达水平。据推测，miRNA可能调控着人体基因组1/3以上基因表达。2.miRNA功能研究方法研究表明，miRNA在发育、细胞增殖、凋亡、脂类代谢、激素分泌及肿瘤发生等多种生理和病理过程中发挥重要作用。针对miRNA的研究方法主要包括两大类：一是以传统实验技术方法为基础建立起来的miRNA特有的技术方法，二是已成熟应用的生物信息学技术。前者侧重于miRNA表达的检测和功能机制的阐明，后者则包括新miRNA基因及miRNA靶基因的预测。在miRNA研究的初期,生物信息学方法发挥了非常重要的作用,Ambros等通过编写相关程序及同源比对从包括人和小鼠在内的多种生物中，预测了大量miRNA分子，并在之后的实验研究中得到验证。从此，生物信息学方法广泛应用于从线虫到果蝇、小鼠、大鼠、鸡、人等多种动物和植物的miRNA分子预测和鉴定[4]。而由传统琼脂糖凝胶电泳Northern杂交发展而来的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)Northern杂交则是鉴定新miRNA分子和获得miRNA表达证据的通用关键技术。2.1.miRNA的实验技术方法具体而言，无论miRNA在某种肿瘤细胞中起到何种作用，首先要探测到该miRNA的存在，传统的方法是northernblot，随后发展的有实时定量PCR等，确认某种miRNA后，要研究其是扮演促进或抑制的角色就需要运用miRNA的抑制和过表达技术。2.1.1.miRNA抑制目前,主要有两种方法可以阻断miRNA的作用：一是敲除miRNA基因或其在靶基因上的结合位点；二是miRNA的序列特异性抑制。然而,由于分子大小的限制,miRNA基因直接敲除的方法并不实用。所以,研究者多使用2′-氧甲基化修饰的反义寡核苷酸抑制剂来阻断miRNA的作用[5]。这种抑制剂是体外化学合成,能与特异性miRNA完全互补的反义RNA,其核糖2′-氧的甲基化修饰能保证反义RNA分子在体内的稳定性，在借助转染试剂进入目的细胞后,能快速并稳定地与内源性成熟miRNA分子互补结合,从而阻止了内源性miRNA分子与靶基因配对。该类抑制剂的转染试剂以Ambion公司的NeoFXTM为代表。目前,这类抑制剂的应用仅限于体外培养的细胞,还不能在动物体内使用。现在,化学合成的2′-氧甲基化修饰的寡核苷酸分子可带有一个3′端的氨基接头,用于与非核苷酸分子(例如:生物素等)的连接。这种与标记物相连的寡核苷酸也可用于miRNA的检测,并可用于与miRNA作用的细胞因子的分离。有研究表明，在黑色素细胞瘤中特异性miRNA-26a抑制剂能够增加SODD的表达，miRNA-26a有可能成为转移性黑色素瘤的治疗靶标[6]。2.1.2.miRNA过表达与常规miRNA的功能研究相似，miRNA的过表达研究也是研究miRNA功能的一种主要方式。可以通过构建miRNA表达载体，或体外直接合成miRNA前体，转入目的细胞两种方式来实现[7]。前者由于可获得稳定的过表达细胞株而应用较为普遍。在前一种方式中，通常先从基因组中扩增miRNA基因及其旁侧序列，然后将其克隆入逆转录病毒或腺病毒载体，最后感染目的细胞观察功能效应。Bartel等通过该方法首次发现了miR-223、miR-181、miR-142在小鼠造血分化过程中起重要调控作用，Fazi等也运用该方法并结合其它技术深入地阐明了miR-223如何通过抑制其靶基因NFI2A来调控人粒细胞分化。这一方法也成功用于多个其它小RNA功能的的研究。以上为最常见的研究miRNA的实验研究技术，除此还有基因芯片、锁定的核苷酸原位杂交等方法。不管是何种方法，都在miRNA的研究中发挥了重要的作用。2.2.miRNA的生物信息学方法生物信息学为miRNA研究提供了有益的线索,可以指导实验的进行。目前,生物信息学在miRNA研究中的应用,主要集中在miRNA基因和miRNA靶基因的预测两个方面。2.2.1.miRNA基因预测虽然分子克隆仍是搜寻miRNA的有效方法，但由于miRNA自身的一些限制，如较短的序列结构、某些miRNA只在特定组织和发育阶段表达等，使这些miRNA很难通过传统的实验方法得到鉴定。随着人们对miRNA结构特点及进化特征等有了越来越多的了解，通过生物信息学方法预测已成为寻找新的miRNA的重要手段。目前，已有很多专门的miRNA基因预测程序发布，大部分的软件预测都主要依据miRNA在进化过程中的保守性以及其茎环结构的前体特征来进行预测。现在常用的预测软件包括miRscan，miRseeker，smaloop。Lai等使用miRseeker软件在果蝇中预测出48个候选miRNA基因,其中20个已被实验确证。Lim等[8]使用miRscan软件，分别在线虫和人中鉴定了30个和38个新的miRNA基因。MirScan采用了一种独特的算法，即首先通过RNAfold软件在广阔的基因组范围寻找保守的并且可以形成茎环结构的序列，这些搜寻结果均被作为候选miRNA前体，然后再根据与已知miRNA的相似性比较，在候选前体中进行评分，得分超过某一设定域值者就为候选的miRNA基因。利用miRscan推测在线虫基因组中miRNA的数目约为120个左右。miRscan也被用来推测其他一些物种，估计在不同物种中的miRNA约占基因总数的1%左右。2.2.2.miRNA靶基因预测与新的miRNA的频频发现相比，miRNA的功能研究相对较缓慢。其中重要的原因是miRNA的作用靶标难以确定。传统方法寻找miRNA靶基因目标不明确，效率低下，且非常耗时。而高通量筛选方法比较复杂，并且价格昂贵，因此利用生物信息学方法搜寻miRNA靶基因成为较理想的途径。与miRNA基因预测相比，靶基因的预测具有更大的难度。因为目前已知的miRNA靶基因数量非常有限,不能为预测提供充足的依据,而且对预测的候选基因的鉴定步骤相对繁琐，很难实现高通量和规模化。自从2003年第1个miRNA靶基因预测软件问世以来，至今已有数十种专业软件被用来预测miRNA靶基因。这些软件的计算法则通常是：（1)种子序列(miRNA5'端2~8nt)和靶基因3'UTR区之间的互补程度；（2)miRNA_靶基因二聚体的自由能大小,即热力学稳定性；(3)靶基因非翻译区序列跨物种的保守性等。目前常用的预测软件有TargetScan、miRanda、DIANA-MicroT、PicTar、RNA22及FindTarr等，但是各种软件均有其利弊，许多研究者综合利用以上软件，将数据结果取并集或交集，从而获得更精准的数据。对于生物信息学方法预测的靶标基因，需再借助荧光素酶报告基因系统、miRNA获得或缺失性实验进一步确认。3.miRNA与肿瘤的关系研究发现miRNA在细胞循环调节中发挥着重要作用，包括细胞分化、细胞凋亡以及细胞增殖，有实验证明miRNA是细胞分化作用的调节器。如在斑马鱼生长初期，细胞未出现分化，大部分miRNA不表达,而到了生长后期，大多数细胞种类都出现时，miRNA会出现组织特异性表达[9]。在细胞凋亡过程中，miRNA同样发挥着重要作用。Liu等[10]在对结直肠癌的研究中发现在体外恢复结直肠癌细胞系中miR-195的表达能促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长，可以将miR-195作为结直肠癌的肿瘤抑制基因。在miRNA与细胞增殖的关系中，Lee等[11]发现miR-373在食管癌病理组织中过量表达促进食管癌细胞增殖。miR-373表达的靶向蛋白为LATS2，它们之间为负向调节关系。失调的miR-373表达导致LATS2蛋白的表达失调，进而出现细胞的生长失调，最终导致食管肿瘤的发生。目前已经识别和鉴定的人类miRNA序列有321个，其中234个被实验证实[12]。研究表明多数miRNA定位在与肿瘤相关的染色体部位，miRNA的异常表达与特定肿瘤有关，可以调控重要的肿瘤相关基因，参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭或血管形成等过程。这些迹象表明，miRNA在人类肿瘤发生、发展中发挥了重要作用。Calin等[13]对已知和预测的186个人类miRNA在染色体上的定位与肿瘤的关系进行了研究，发现半数以上的miRNAs定位于与肿瘤发生相关的染色体区域和脆性位点，如杂合性缺失区(LOH)、纯合性缺失区(HD)、扩增区、断裂点区、靠近癌基因或抑癌基因的部位。以下为几种常见的miRNA与肿瘤的关系进行讲述。3.1.miR-15和miR-16与肿瘤Calin[14]等用定位克隆技术发现这两种miRNA定位于染色体13q14的LEU2区域内。在65％的慢性淋巴细胞白血病(cLL)患者中表达下降或缺失。miR一15a和miR-16a与Bcl-2含有9bp互补序列，可以抑制BcL-2蛋白表达，进而诱导肿瘤细胞凋亡。miR-15和miR-16丢失导致BcL-2过表达是人类cLL发生的重要机制。人们推测，miR-15和miR-16可能成为过表达BcL-2肿瘤的一种行之有效的“治疗药剂”[15]。Fabbri等[16]更深层次地揭露了miR-15a、miR-16-1基因簇在cLL中的作用机制，研究显示miR-15a、miR-16-1基因簇的缺失不仅活化了抗凋亡基因Bcl-2的表达，而且也上调了抑癌因子TP53的表达，因此在一定程度上减缓了肿瘤生长。3.2.miR-21与肿瘤研究表明miR-21定位于染色体17q23.2。miR-21在胶质母细胞瘤中的表达水平是正常细胞的5-100倍。早期已有实验证明miR-21能够抑制凋亡而促进肿瘤生长，CorstenMF等[17]发现在神经胶质瘤细胞中miR-21的表达升高,敲除miR-21能促进细胞凋亡,联合抑制miR-21与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,可导致凋亡相关蛋白半胱天冬酶活性的提高及神经胶质瘤细胞生存能力的显著降低,动物活体实验验证了该观点,提示miR-21可作为介入治疗的靶标。也有研究证明，下调miR-21抑制EGFR途径和抑制恶性脑胶质母细胞瘤的生长而不