抗生素微生物检定标准操作规程

抗生素微生物检定标准操作规程1简述抗生素微生物检定法系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。中国药典也采用这两种方法。抗生素微生物检定管碟测定法系琼脂扩散法，是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。抗生素微生物比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验菌的液体培养基内，混均后，经培养，测量培养基浊度。此法系根据抗生素在一定的浓度范围内，其浓度或浓度的数学转换值与试验菌生长产生的浊度（浊度与细菌群体质量及细菌细胞容积的增加之间存在直接关系）之间存在线性关系而设计，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，计算出供试品的效价。抗生素效价以“单位（u）”或“微克（µg）”表示。抗生素管碟测定法2仪器与用具2.1操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100级～10，000级）及空调设备，控制室温在20～25℃之间，达到无菌或半无菌状态。操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。注意操作，避免室内抗生素污染。2.2双碟内径约90mm，高16～17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一张白纸，碟内加水2～3ml，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。用过的双碟经高压灭菌倒出培养基后，置清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，至150℃～160℃干热灭菌2小时或高压121℃蒸气灭菌30分钟，备用。2.3陶瓦盖内径约103mm，外径108mm，平坦，吸水性强，应定期清洗、干燥或干热灭菌。2.4钢管内径（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm；外径（8.0±0.1）mm或（7.8±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光洁平坦，管壁厚薄一致。每次使用后应置1:1000新洁尔溶液内，浸泡2小时以上，灭菌后再洗涤，先用水洗涤，超声波超声30分钟或用沾有去污粉的纱布条串擦内外壁，水冲洗，沥干，再用蒸馏水冲洗3次后，置带盖的容器内，在150℃～160℃干热灭菌2小时，备用。2.5钢管放置器有6孔和4孔两种。放置于无菌或半无菌室的操作平台上，钢管下落时应垂直平稳、位置正确。双碟升降平稳。应保持清洁，防止抗生素污染。可定期用75%乙醇棉擦拭落管筒及储管杯。置钢管的玻璃管应定期干烤灭菌。2.6恒温培养箱以隔水式为宜，温度平稳，波动小。设置漂移温度为35～37℃或24～26℃，依各品种要求而定，箱内网状隔板上放置带孔的玻璃板并调整水平。2.7灭菌刻度吸管用于吸取菌液及培养基。使用后应立即置5%石炭酸或1:1000新洁尔溶液中消毒后，再按玻璃容器的常规洗涤法洗涤。洗涤沥干后在吸口处塞入脱脂棉（松动，透气），置适宜容器中，在120℃以上干热灭菌2小时或121℃蒸气灭菌30分钟，烘干备用。2.8玻璃容器包括定量移液管、刻度吸管、容量瓶等，均应符合“常用玻璃量器国家计量检定规程”的规定。每次使用前用清洁液浸泡，水冲洗，并用蒸馏水或去离子说冲洗3次，沥干。2.9称量瓶重量在10g以下。用毕先用水冲洗、沥干，置清洁液浸泡2小时以上，然后分别用水、蒸馏水或去离子说冲洗3次，置洁净平皿中，在120℃干热灭菌3小时，待冷至60～70℃时，取出置于干燥中备用。2.10滴管用玻璃管拉制，管口光滑。使用前在清洁液浸泡，分别用水、蒸馏水后去离子水冲洗3次，置适宜容器中，在120℃干燥3小时后备用。2.11天平分析天平，精密度0.1mg，经计量检定。2.12抑菌圈直径（面积）测量仪应符合“抑菌圈测量仪检定规程”的规定。2.13游标卡尺精度0.05mm，长度125mm。2.14超净工作台有效工作面局部洁净度100级。用于试验菌的接种传代或菌悬液制备。超净工作台须置洁净工作室或半无菌室内。3试液3.1灭菌缓冲液制备缓冲液的试剂应为分析纯，配制后的缓冲液应澄明，分装于玻璃容器内，经121℃蒸气灭菌30分钟备用。3.1.1磷酸盐缓冲液（pH6.0）取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过。3.1.2磷酸盐缓冲液（pH7.0）取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使成1000ml，滤过。3.1.3磷酸盐缓冲液（pH7.8）取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过。3.1.4磷酸盐缓冲液（pH10.5）取磷酸氢二钾35g，加氢氧化钾液，加水使成1000ml，滤过。4培养基配制培养基的各成分原料质量对抑菌圈边缘清晰度及试验结果影响较大，因此应对原材料进行预试验，挑选适当的品牌使用。制成的培养基不应有沉淀，如产生沉淀，可在配制培养基后，于115℃加热20分钟溶化，趁热用纸浆减压或适宜方法过滤，调整pH值，分装灭菌备用。中国药典2005年版二部附录的抗生素生物检定法中收载了13种不同处方的培养基及制备方法。目前，已有市售干燥培养基，使用方便。临用时按照使用说明进行配制，但应注意核对培养基的pH，必要时需调节pH，使其符合规定。另外，市售干燥培养基的质量也存在差异，注意选择合适的产品。5试验菌5.1菌种的复苏检定用标准菌种为冷冻干燥品，由中国药品生物制品检定所提供。5.1.1取冻干菌种管、灭菌1ml毛细滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面，移入接种室操作台或超净工作台。5.1.2将冻干菌种管外壁用碘酒（碘状）擦拭消毒，稍干，用75%乙醇棉球擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基，滴在上述灼热的菌种管封口端，使其骤冷炸裂。5.1.3取灭菌镊子，在酒精灯火焰上方，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动是其溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将毛细滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养琼脂斜面置35～37℃培养22～24小时。5.1.4取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌，涂片并进行革兰氏染色镜检，如呈典型菌落，则转种3代即可使用。菌落不典型时，可进行平板分离单菌落。5.2菌种的接种与保存5.2.1准备需用的培养基，培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。在标签上注明菌名及接种日期。从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。5.2.2点燃酒精灯或煤气灯等，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒种，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰上方。塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折蛇形移动，使细菌接种在斜面的表面上。5.2.3取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。5.2.4将已接种的细菌管置35～37℃培养22～24小时，霉菌管一般置24～25℃霉菌培养箱内培养7天。培养后放入4℃冷藏箱内保存，一般1～3个月转种一次。5.3菌悬液的制备5.3.1枯草芽孢杆菌[BacillussubtilisCMCC（B）63501]悬液取枯草芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，加灭菌水1～2ml将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬液接种至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，均匀摊布，在35～37℃培养7天。取菌苔少许涂片，革兰氏染色镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水10ml将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，在65℃水浴中加热30分钟将菌体杀死，待冷后置4℃冷藏箱贮藏。此菌液为浓菌液。日常试验用菌液取上述浓溶液，用灭菌水1:3稀释至灭菌试管中，冷藏箱保存备用。5.3.2短小芽孢杆菌[BacillussubtilisCMCC（B）63202]悬液取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备芽孢悬液。5.3.3金黄色葡萄球菌[StaphylococusaureusCMCC（B）26003]悬液取金黄色葡萄球菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种至营养琼脂斜面上，在35～37℃培养22～24小时，临用时，用灭菌水将菌苔洗下，制成悬液。置4℃冷藏箱保存，可使用3天。5.3.4藤黄微球菌[MicrococcusluteusCMCC（B）28001]悬液取藤黄微球菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，用1ml培养基Ⅲ将菌苔洗下，用吸管移至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶中，均匀摊布，将培养瓶倒置于培养箱中26～27℃培养24小时取出，用吸管吸取培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液5ml至培养瓶中，将菌苔洗下，合并菌液至灭菌大试管中备用。置4℃冰箱中保存，可使用1～2个月。5.3.5大肠杆菌[EschehchiacoliCMCC（B）44103]悬液取大肠杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照金黄色葡萄球菌菌悬液项下的方法制备菌悬液，供当日使用。5.3.6肺炎克雷伯氏菌[KlebosiellapneumoniaeCMCC（B）46117]悬液取肺炎克雷伯氏菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照金黄色葡萄球菌菌悬液项下的方法制备菌悬液，供当日使用。5.3.7啤酒酵母菌[Saccharomycescerevisiae9736]悬液取啤酒酵母菌的V号培养基琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种于Ⅳ号培养基斜面上，在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下，放至含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，以当日使用为宜。试验菌的菌龄对抑菌圈边缘清晰度有一定影响，应保持菌种新鲜。对易变异的菌株如藤黄微球菌等，宜在制备菌液前进行单菌落的分离，选择典型菌落以保持菌悬液中菌群的一致性，以使所得的抑菌圈边缘清晰、整齐。6操作法6.1称量6.1.1称量前先将标准品从冰箱中取出，使其温度与室温平衡。6.1.2供试品与标准品的称量应使用用一架天平；对于吸湿性较强的抗生素，应在称量前1～2小时更换天平内干燥剂。6.1.3标准品与供试品的称量尽量一次取样称取，不得将已取出的称取物倒回原容器内。标准品的称取量不得少于20mg，取样后立即将盛有样品的称量瓶或适宜的容器用盖盖好，以免吸水。称样量的计算：W=V·CP式中W为需称取标准品或供试品的重量（mg）；V为溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积（ml）；C为标准品或供试品浓溶液的浓度（u/ml或µg/ml）；P为标准品的纯度或供试品的估计效价（u/mg或µg/mg）。6.2稀释稀释操作应遵照容量分析的操作规程进行。6.2.1用于溶解及稀释标准品或供试品的容量瓶和移液管等玻璃量器，应按“常用玻璃量器国家计量检定规程”进行标定，符合A级的要求。每步稀释，量取量不得少于2ml，稀释步骤一般不超过3步。举例：量取贮备液（1000u/ml），进行以下稀释。50ml量瓶，稀释至刻度第一步精密量取5ml（1000u/ml）100u/ml50ml量瓶，稀释至刻度第一步精密量取5ml（1000u/ml）10u/ml（H）100ml量瓶，稀释至刻度第一步精密量取5ml（1000u/ml）5u/ml（L）6.2.2量取供试品溶液尽量使用刻度移液管，正式量取前要用供试液流洗2～3次，