MSP与BSP

BSP和MSP区别：1）检测的内容不完全相同BSP引物不包括CpG位点，在CpG位点的上下游，扩增后通过测序检测改位置的甲基化状态(测序如果CG不变则为甲基化，如果CG变为TG则为非甲基化）MSP/USP是根据修饰后甲基化和非甲基化的引物不同扩增出不同的条带而判断是否为甲基化(只扩增出MSP条带表明为甲基化，如果扩增出USP则表明为非甲基化）2）MSP原理：甲基化特异性PCR(MSP)其原理为：双链DNA变性解链后，在HSO3-作用下发生C→U转化，C若已有甲基化则无此改变；甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G相联结构的C上，因此在HSO3-作用后，DNACpG岛若无甲基化，则序列中的改变为C→U，CG→UG，若有甲基化则为C→U，CG→CG，用不同的引物做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。从理论上说，DNA发生甲基化的MSP产物的序列与原序列比较，变化为C→T，CG→CG，相应其互补链的改变为G→A，CG→CG。然后根据目的基因修饰前后的改变，相应设计M和U引物，有时我们需要设计两轮引物！BSP法原理：用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶则不变。基因组DNA经亚硫酸盐处理后，设计BSP引物扩增目的片段，此时尿嘧啶（U）全部转化为胸腺嘧啶（T），最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。3)一般用BSP找到甲基化位点，然后根据甲基化位点设计MSP引物，摸索条件以得到最优检测甲基化的方法。BSP因为涉及测序，其结果准确但要求克隆时所挑克隆较多等原因，操作繁琐，不易大批量操作。MSP则可以检测大量标本并用于检测。详细参见引物和探针你可以查文献看别人设计好的，然后再找公司合成，也可以自己设计1、ABIMethylprimerExpressDNA甲基化引物设计软件使用ABIMethylprimerExpressDNA甲基化引物设计软件使用-丁香园论坛=甲基化引物设计#141597232、甲基化的一些旧贴总结整理较全的甲基化（MSP)原理及问题总结，希望对大家有帮助！-丁香园论坛=荧光定量方法测甲基化#91849273、荧光探针设计软件操作说明荧光探针设计软件操作说明-丁香园论坛=甲基化探针设计#6763407DNA甲基化PCR引物的设计.pdf(931.16k)在线查看精品：荧光定量PCR技术原理与结果分析..pdf(2157.35k)在线查看关于DNA甲基化引物设计除了常用的在线设计工具MethPrimer::公司还给我们提供了另外一个选择：MethylprimerExpress，并且这个工具还是免费的。下载地址：=catNavigate2&catID=602121&tab=Overview需要在网站上免费注册，才能下载。软件的下载和安装，就不啰嗦了。打开软件，主界面就是一个简单的框框，可以通过File→ImportSequence导入doc或者txt的序列文件，也可以用Edit→Paste或者直接Ctrl+V粘贴已经拷贝的序列。这里以hMLH1基因为例，在UCSCGenomeBrowser中获得该基因CpG岛序列。粘贴到上述对话框中，在SequenceFeatures菜单中，RenumberSequence对输入的序列进行重新排布，可以去除序列中的空白区域。EnterSequenceName输入序列名称等信息。点击DesignPrimers→FindCpGIslands。弹出对话框点击No，使用默认值进行搜索。选择Yes，弹出CpGIslands选项，可对其进行自定义。完成后，一路Next，默认是按预测出来的CpG岛设计。在对话框中用橘黄色标识出来。如果有特殊的要求，可以用鼠标选择感兴趣的区域，然后再Next。在弹出的对话框中提供了简单的选择区域的信息，在对话框下方，选择你所需要的引物类型，包括MSP（methylation-specificPCR）和BSP（Bisulfitesequencing）。以MSP为例，选择DesignMSPPrimers，单击Next。同样，点击No，使用默认值进行搜索。选择Yes，在MSPPrimers选项卡中，可对其进行自定义。有人认为该软件得到的引物Tm值偏低，可以在此处将Tm值略微提高。在该选项卡的下方，有一个搜索的选项，将滑块移向最右侧，速度最快，精确性最低；滑块在最左侧表示速度最慢，但精确性最高。不同的选择得到的引物确实有比较大的差异。反正我每次都让它慢慢来，不差那几分钟时间。等计算机一阵狂算之后，得到了一系列引物（下图1处）。越靠近横轴的，分值越高。单击你需要的引物（反白显示），在下图2处会显示引物的详细信息。也可以选择MSPPrimerReport（下图3处）获得详细的引物报告。对于获得的引物，可以在methBLAST（）中验证其特异性如何。也可以用Oligo6等软件来评价所设计引物的质量。常见问题MSP原理：甲基化特异性PCR(MSP)其原理为：双链DNA变性解链后，在HSO3-作用下发生C→U转化，C若已有甲基化则无此改变；甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G相联结构的C上，因此在HSO3-作用后，DNACpG岛若无甲基化，则序列中的改变为C→U，CG→UG，若有甲基化则为C→U，CG→CG，用不同的引物做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。从理论上说，DNA发生甲基化的MSP产物的序列与原序列比较，变化为C→T，CG→CG，相应其互补链的改变为G→A，CG→CG。然后根据目的基因修饰前后的改变，相应设计M和U引物，有时我们需要设计两轮引物！试验中的对照体系能保证MSP反应体系可靠性，MSP阳性对照选取的方法有以下几种：（1）查文献找目的序列MSP阳性的细胞，用其修饰后DNA做阳性对照。（2）购买商品化的MSP阳性对照，但较昂贵。（3）自制MSP阳性对照：用CpG甲基化酶(M.SssI)处理胎盘DNA做阳性对照。因为CpG甲基化酶M.SssI能识别并甲基化CpG识中所有C,使其与MSP方法所理想的DNA状态一致，可模拟生物基因组的修饰模式，故可用来做阳性对照。方法如下：先用CpG甲基化酶（NEB公司）在37℃下处理胎盘组织DNA1h,再经亚硫酸氢钠修饰后，即可做阳性对照用于优化MSP的反应。（甲基化方法步骤）(石蜡组织DNA甲基化检测)(阳性对照)(修饰过程中是否糖原可以不用)(第二轮模板稀释)(试剂的配置)（试剂的处理）://（手工修饰和试剂盒修饰的差异)常见问题MSP结果分析-丁香园论坛（MSP产物弥散）MSP结果不稳定，重复性很差=67&id=9295899&sty=1（本人做的总结）://（个人觉得很好，对重复性差的解释）（血清DNA提取MSP的讨论，个人觉得不错）（甲基化模板的提取）（Chemicon公司的CpGenome甲基化试剂盒做MSP的问题）回复：【求助】dNTPs与dNTP的区别-丁香园论坛（甲基化中dNTPs与dNTP的使用注意区别）（甲基化中SssI酶哪里买）（甲基化与部分甲基化的区别）（DNA甲基化攻略）MSP引物相关问题（引物探讨）=87&id=6169630&sty=3&keywords=%BC%D7%BB%F9%BB%AF%BC%EC%B2%E2(肿瘤基因甲基化引物总结)（甲基化中W，U，M三对引物问题）(引物设计)（引物设计）（甲基化荧光定量PCR引物问题）（引物设计网站）甲基化检测时MSP引物设计原则及相关问题-丁香园论坛（引物设计原则及相关问题）回复：【分享】甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）-丁香园论坛(精华贴)案例分析1:我最近在做的课题涉及到基因甲基化的检测，用到了MSP方法。但是目前初步试验了几次结果不是很理想。现在我先提取的正常人外周血淋巴细胞DNA，然后做亚硫酸氢钠修饰，提纯之后跑PCR，没有成功。我想可能在修饰这一步不是很成功。想请教一