MTT方法总结

整理文档很辛苦,赏杯茶钱您下走!

免费阅读已结束,点击下载阅读编辑剩下 ...

阅读已结束,您可以下载文档离线阅读编辑

资源描述

MTT方法总结1.MTT原理MTT比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法,所用的显色剂是一种能接受氢原子的化合物MTT,原理是,活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTT还原为蓝紫色的结晶formazan(甲瓒)后者的产量与活细胞数成正相关。formazan可用DMSO、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解,在酶标仪上以波长490nm和570nm处进行比色。所检测的OD值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。2.优点(1)有灵敏度高,重复性好,(2)操作简便、经济、快速、易自动化的优点,(3)而且没有3H—TdR掺入试验放射性污染,(4)还可以减少如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验中的人为性因素缺点:影响因素多,重复性较差。MTT有毒性致突变性,操作时应注意防护3.步骤(1)接种细胞:用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,用含10%胎牛血清的RPMI1604培养液配成单个细胞悬液,以每孔5×103~1×104个细胞接种于96孔培养板中,每孔体积200ul。(2)培养细胞;将培养板移入CO2孵箱中,在37℃、5%CO2及湿度条件下,培养4h以上(至细胞状态稳定).加药物干预24~48h(培养时间取决于实验目的和要其求)(3)呈色:加MTT时一定要避光,测24h细胞增殖率时,于加药干预20h后,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20ul,37℃,继续孵育4h;测48h细胞增值率时,于加药干预44h后,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20uL,继续孵育4h。终止培养后,对悬浮生长的细胞,需离心,(2000rpm.15min);对贴壁细胞最好也离心(2000rpm,3min).然后用1mL或3mL注射器小心吸弃孔内培养上清液,每孔加入150uLDMSO振荡10min,使结晶物充分溶解。(4)比色:选择490nm和570nm波长,在酶联免疫检测仪上调定各孔收值,记录结果。以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生线。4.注意事项(1)选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,接种前需计数,根据查阅文献决定不同细胞的接种个数,一般以每孔5×103~1×104个细胞接种于96孔培养板中,每孔体积200uL。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,对每一种细胞都其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。(2)实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。(2)避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于l0%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。(3)加药时,每种药5个浓度(每个浓度相差10倍),一个浓度设4个副孔。(4)设空白对照和正常对照,每块板设空白复孔,内加培养液,不含细胞与药物,各做4~6个复孔,取平均值,主要目的是为了减少培养基含有的酚红对比色的影响。每种细胞设4~6个正常对照孔,含细胞不含药物,每孔加样100μL/孔。(对照,不含细胞,含药物和培养基?)(5)细胞铺板时,要充分分散,而且要加几个孔就重新吹散一次,否则,细胞浓度就会不同。(我曾经试验过,用后加的孔作试验组与用先加的孔作对照组,结果有些差异,也许是我的熟练程度不行!)另外,吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。(6)培养后,细胞的培养既要吸干净,否则,残留的蛋白会对MTT有一定的吸附作用,影响就过准确性。我使用的是翻转法,将培养液倒掉,这样做很简便,又很快洁。重复性也不错。(7)测吸光度值要有一定的时间范围,在测定是你会发现,随着时间的推移没空都会变深些,(这可能是由于MTT在空气中氧化的结果,我记不清了,你再找找书,另外,具体时间我也没有记清)(8)阳性药物的选择,要选择经典的,有说服力的,又对你的细胞有很好的杀伤了力的药物。别认为简单,我就曾经因为阳性药物选择错误而重新做试验,惨痛的教训呀!!(9)如果用96孔板,周围一圈孔的值由于液体蒸发和温度梯度原因,会误差很大,尽量不用。(10)溶解甲臢时,如果是悬浮细胞或细胞贴壁不牢,尽量用酸性SDS溶解,不要弃去培养液,以免细胞损失。这还要求最后加入药物和MTT时,血清浓度低于10%。6.如何计算IC50用抑制率作为Y,加药浓度的对数作为X,进行线形回归,根据得到的方程求抑制率是50%时的加药浓度,也就是IC50。IC50的计算和LD50的计算很相似,可以用SPSS计算。以剂量为横坐标,以抑制率为纵坐标(Y)。进行回归分析也可以,即用抑制率作为Y,加药浓度的对数作为X,进行线形回归,根据得到的方程求抑制率是50%时的加药浓度,也就是IC50。但是这有要求:抑制率最好在30-70%之间才能采用回归,因为这一段几乎是直线关系。我的经验是,因为药物的作用通常是一条S型曲线,在药物浓度很高或很低的时候就接近一个平台,所以加药剂量的选取非常重要,在不知道药物大概的IC50的时候,可以各个剂量之间10倍稀释,这样加药的范围就比较宽,可以摸索到合适的剂量,如果已经有参考的剂量,也可以等倍稀释。如果你得到的抑制率能够分布在50%上下各有几个点,那么以线形回归法得到的结果一般是比较准确的。MTT法本身并不是非常准确,一般要重复3次,得到的结果差不多才可信。MTT大汇总实验前应明确的问题1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。2.药物浓度的设定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3.时间点的设定。在不同时间点的测定OD值,输入excel表,最后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。4.培养时间。200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持68h,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48h换液的。5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。做MTT时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。7.实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。8.避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。实验步骤贴壁细胞:1.收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。2.5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况3.5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。4.每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。5.终止培养,小心吸去孔内培养液。6.每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)悬浮细胞:1)收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640(无血清)培养基40ul;②加ActinomycinD(有毒性)10ul用培养液稀释,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加储存液1001640)。2)置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。3)每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)4)离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。5)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。MTT的配制MTT一般最好现用现配,过滤后4ºC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBSph=7.4溶解,也有人用生理盐水配,60℃水浴助溶。PBS配方:Nacl8gKcl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g调ph7.4定容1L关于细胞的接种(铺板)细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的(最好进口板),不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种,因为细胞密度在10000/ml左右时,所测得的OD值的区间即细胞抑制率(或者增值率)的所呈现的线性关系最好,结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显,太密细胞可能都会凋亡,因为细胞长的太快营养会不够,最后导致死亡。且而细胞过密或者过少,增殖都会过快或者过慢,其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml,100ul/孔。细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度,如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度,这样与对照的区别更明显,数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.其它的声音:1.首先细胞的接种密度一定不能过大,一般每孔1000个左右就够了,我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了,这样即使药物有作用,MTT方法也是表现不出的,最佳点板浓度在4000-5000/孔,太少的话SD值会很大。2.MTT本身就是比较粗的实验,增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手,20%的波动也是常见的,所以很可能是技术原因引起的,特别是种板技术一定要过关。3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度

1 / 13
下载文档,编辑使用

©2015-2020 m.777doc.com 三七文档.

备案号:鲁ICP备2024069028号-1 客服联系 QQ:2149211541

×
保存成功