MTT法测定生长曲线标准化流程sop

MTT法测定生长曲线标准化流程（SOP）一、基本原理及实验目的MTT比色试验是一种检测细胞存活和生长的方法。其原理是活细胞中某些物质能和MTT反应。方法是利用DMSO溶解此结晶后，再用酶联免疫检测仪在490nm波处检测吸光度值。此方法在生气活性因子的活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性实验以及肿瘤放射敏感性测定等实验中广泛应用。它具有灵敏度高、重复性好、经济、快速等优点。二、主要仪器及试剂1．MTT溶液：称取100mgMTT粉末加入20mlPBS中，搅拌30min，使之充分溶解，过滤除菌，分装，4℃保存，2周内有效。2．0.25%胰酶、含血清培养基、DMSO。3．96孔板、移液器、离心管、血球计数板、酶联免疫检测仪等。三、操作步骤1.常规消化细胞，离心收集细胞沉淀。2.含血清培养基重悬，制成单细胞悬液。3.细胞计数。4.按一定的倍数稀释细胞悬液，调整细胞浓度至1×104个/ml.5.用移液器吸取约200ul稀释后的细胞悬液，加入96孔板，每板接种5孔，共接种9块96孔板。并设置一对照孔，只加培养基。6.放入孵箱常规培养，以后每隔两天换液1次。7.第2天选择某一固定时间取出一块96孔板，每孔加入MTT溶液20ul。8.37℃孵育4h后，小心吸弃孔内上清。9.每孔加入150ulDMSO，震荡10min，使结晶充分溶解。10.在酶联免疫检测仪上选择490nm波长测定测定吸光度值，计算5孔的平均值。11.以后每隔24h取出一块96孔板重复6～9的操作。12.利用作图软件（如Excel等），以时间为横轴、吸光度值为纵轴绘制生长曲线。四、结果判读实验所得的曲线应当是一条类似“S”形的曲线。前1～3天内细胞处于潜伏期，随后进入对数生长期，最后的几天进入平台期。因为在相同体积内细胞数与吸光度值成正比，所以在对数生长期，曲线的斜率越大说明细胞的群体倍数时间越短。五、注意事项1.接种细胞时选择合适的细胞浓度。2.残存的血清可能影响实验结果，因此吸弃培养上清时尽量将残存的培养液吸干净。3.必须设置空白对照，而且对照孔除了不加细胞外，其余操作预实验孔完全相同。比色时，以空白孔调零。