newtech--RNApulldownprotein(RNAIP方法)

lncRNA与蛋白互作技术：RNA-ProteinPull-Down/RIP(2013-07-0511:29:49)lncRNA与蛋白互作技术：RNA-ProteinPull-Down/RIP1、Thermofisher试剂盒近日，赛默飞世尔科技全新推出了一款PierceMagneticRNA-ProteinPull-DownKit，让研究人员能够以末端标记的RNA作为诱饵，轻松富集蛋白质-RNA的相互作用。与抗体捕获相比，这种方法的优势在于脱硫生物素化的目标RNA能够直接富集RBP（或复合物）。蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。了解它们之间相互作用的分子机制对理解这些生物学过程非常重要。然而，之前的分析方法往往受限于使用放射性标记，或实验步骤过多，不仅耗时费力，也增加了实验结果的不稳定。此试剂盒利用脱硫生物素末端标记的RNA和链霉亲和素磁珠标记的来高效富集RNA结合蛋白（RBP）。与抗体捕获相比，这种方法的优势在于脱硫生物素化的目标RNA能够直接富集RBP（或复合物）。此外，试剂盒还提供了经过验证的对照，适用于标记和pull-down分析，也与多个下游应用兼容，如Westernblotting和质谱（MS）。试剂盒中包含了PierceRNA3’-EndDesthiobiotinylationKit。它利用T4RNA连接酶将单个脱硫生物素化的胞苷二磷酸连接到单链RNA的3’端。3’端的末端标记不干扰RNA结构，因此，比标记核苷酸的随机掺入更加理想。每个标记反应适合50pmolRNA；不过，如有必要的话，标记反应也可扩展（从1pmol到1nmol）。标记反应需要20倍过量的脱硫生物素化核苷酸。对于不太复杂的RNA，孵育时间可为37°C30分钟，若是更长或更复杂的RNA，时间也延长到4-16°C过夜。通过改变RNA与核苷酸的比例，延长孵育时间，或在标记反应中添加DMSO，可优化复杂RNA的标记效率。RBP的富集过程经过优化，相当简单。首先将RNA与链霉亲和素磁珠结合。之后在蛋白质-RNA结合缓冲液中平衡RNA结合的磁珠，再加入蛋白裂解液。随后添加适当的缓冲液、涡旋振荡，并在磁力架上分离，洗涤磁珠。最后样品可通过非变性的生物素洗脱缓冲液或SDS-PAGE上样缓冲液洗脱，用于下游分析。此试剂盒的特点在于：直接：直接利用末端标记的RNA捕获核糖核蛋白复合物；不需要使用抗体进行pull-down;简单：RBP富集过程无需离心；步骤简化，在RNA标记反应后手工操作不到3小时灵活：使用不同长度的体外转录RNA或合成RNA进行标记；可成功富集内源、过表达和体外翻译的裂解液中蛋白;特异：磁珠背景低；未处理的RNA或突变RNA不会明显富集特定的RBP;经济：比单独购买合成的末端标记RNA、磁珠和试剂更为经济;完整：包含标记和富集组分及分析缓冲液；阳性对照RNA、阴性对照RNA和RBP抗体也包含在内此试剂盒包含的试剂足够20次RNA标记反应和20次蛋白质-RNApull-down分析使用。2、milipore试剂盒MagnaRIP™RNA-BindingProteinImmunoprecipitationKitDescription:MagnaRIP™RNA-BindingProteinImmunoprecipitationKitTradeName:Upstate(Millipore)Qty/Pk:12assaysProductOverview:RNA-bindingproteinimmunoprecipitation(RIP)istheRNAanalogofthemorewell-knownChIPapplication(chromatinimmunoprecipitation),whichidentifiesDNAtargetsofDNA-bindingproteinsinanin-vivocellularcontext.RIPcanbeusedtoidentifyspecificRNAmolecules(ofmanytypes)associatedwithspecificnuclearorcytoplasmicbindingproteins.TheseexperimentsinvolveimmunoprecipitationofendogenouslyformedcomplexesofRNA-bindingproteinsandco-isolationofanyRNAspeciesassociatedwiththatRNA-bindingprotein.PurificationoftheseRNAspeciesallowsinterrogationandidentificationofmRNAs(andpotentiallynon-codingRNAsassociatedwiththem)andcanbedirectlymeasuredusingdownstreamapplicationsincludingquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR),microarrayanalysis(RIP-chip)and“deep-sequencing”or2nd-generationsequencingbasedplatforms(RIP-Seq).Features&Benefits:-ProteinA/Gmagneticbeads,optimizedtobindnucleicacid-proteinimmunecomplexes-RNAseinhibitorsandRNAse-freereagents-Negativecontrols«CollapseKeyApplications:RNABindingProteinImmunoprecipitation(RIP)«CollapseComponents:MagneticBeadsProteinA/GRIPWashBufferRIPLysisBuffer0.5MEDTA10%SDSSaltSolutionISaltSolutionIIPrecipitateEnhancerNormalMouseIgGRabbitIgGPurifiedProteaseInhibitorCocktail200XRNaseInhibitorProteinaseK(10mg/mL)NucleasefreewaterViewAll»3、AbcamRNAImmunoprecipitation(RIP)RIPprotocolPDFInterestinRNA-proteininteractionsisboomingaswebegintoappreciatetheroleofRNA,notjustinwell-establishedprocessessuchastranscription,splicing,andtranslation,butalsoinnewerfieldssuchasRNAinterferenceandgeneregulationbynon-codingRNAs.RIPisanantibody-basedtechniqueusedtomapRNA–proteininteractionsinvivobyimmunoprecipitatingtheRNAbindingproteinofinteresttogetherwithitsassociatedRNAandallowsidentificationofboundtranscripts.RIPprecipitatesaspecificRNAbindingprotein(RBP)andassociatedRNA(mRNAs,noncodingRNAs,viralRNAs)thatcanbedetectedbyreal-timePCR,microarraysore.g.sequencing.HereisaRIPprotocoladaptedfromKhalilaetal.PNAS2009,Hendricksonetal.2009,Hendricksonetal.2008andfromRinnetal.Cell2007.ReagentsNuclearisolationbuffer1.28Msucrose40mMTris-HClpH7.520mMMgCl24%TritonX-100RIPbuffer150mMKCl25mMTrispH7.45mMEDTA0.5mMDTT0.5%NP40100U/mlRNAaseinhibitorSUPERASin(addfresheachtime)Proteaseinhibitors(addfresheachtime)