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自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的重要组成部分,是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞。与T淋巴细胞不同,NK细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞,是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞[1]。人类NK细胞约占全血淋巴细胞的10%～15%。目前研究认为NK细胞特异性表达CD56,而缺乏T细胞抗原CD3。NK细胞具有以下功能:(1)对病毒感染细胞、白血病细胞及其他肿瘤细胞产生直接细胞毒活性;(2)分泌多种免疫调节细胞因子(如:IFN-γ,TNF-α,GM-CSF);(3)通过细胞膜FcγRⅢ(CD16)与抗体Fc段结合从而介导抗体依赖的细胞毒(ADCC)作用NK细胞临床应用进展2.1体内扩增、激活NK细胞目前NK细胞的免疫治疗主要是利用细胞因子体内扩增、激活NK细胞和体外产生LAK、CIK细胞杀伤自体肿瘤细胞。从早期的大剂量IL-2治疗的严重毒副作用到随后的长期小剂量联合间断中剂量IL-2治疗证实在HIV感染及恶性肿瘤患者中可以较好耐受。但这种治疗方法只是增强骨髓祖细胞向NK细胞分化及依赖IL-2延迟NK细胞的凋亡,而并非外周血成熟NK细胞的增生[14,15]。因此联合应用IL-2和其他细胞因子(如IL-12,IL-15,KL,FL)可能达到更好的体内和体外扩增NK细胞的效果[16,17]。但是由自体肿瘤细胞上表达的MHC-Ⅰ类分子所介导的抑制性信号仍然是成功治疗的最大限制。2.2体内阻滞抑制性受体在自体和HLA相合的干细胞移植中,白血病细胞表达MHC-Ⅰ类分子与NK细胞的抑制性受体结合从而抑制NK细胞对自体白血病细胞的杀伤。Koh等[18]最近利用急性白血病小鼠模型证实在体内阻滞NK细胞抑制性受体的可行性。给B6鼠接种C1498(H2d)鼠的白血病细胞,利用5E6F(ab')2抗Ly49C和Ⅰ抗体治疗可以避免B6鼠死于白血病,治疗中未发现明显的毒副反应及对造血的破坏。另外输注经5E6F(ab')2体外处理后的IL-2激活的NK细胞与未经处理的对照组相比可以使小鼠避免因白血病死亡。可以将CD+34细胞与在F(ab')2作用下活化的NK细胞共孵育达到体外净化自体干细胞,但是人类CD+34细胞对异体反应性NK细胞的敏感性会限制这种方法的应用。选择性应用NK细胞抑制性受体阻滞剂可以增强免疫系统对病毒感染的免疫反应。2.3调节活化性受体及配体正如早期研究证实NK细胞的功能依赖于相应的抑制性和活化性受体介导的抑制性和活化性信号的平衡。除了可以阻滞抑制性受体,是否可以利用细胞因子来诱导或上调NK细胞表面的活化性受体的表达以打破这种平衡。IL-2可以诱导在静止NK细胞表面缺乏的自然细胞毒受体NKp44。初步的研究发现NCR的表达密度可能是恒定的,并不受IL-12,IL-15,IL-12,IL-18影响[1]。目前尚未发现影响NKG2D表达水平的细胞因子报道。但活化后的NK细胞表现出的明显强于未活化的NK细胞的肿瘤靶细胞杀活性的事实,预示着调控NK细胞表面受体的表达及肿瘤细胞相应配体的表达必将为临床治疗提供新的策略。2.4同种异体反应性NK细胞与造血干细胞移植(HSCT)早在2002年Karre就已经对NK细胞在促进造血干细胞植入、降低移植物抗宿主病(GVHD)发生以及增强移植物抗白血病(GVL)效应等方面的作用进行了详细的评述[19]。当供者NK细胞的抑制性受体不能与其HLA-Ⅰ类配体结合或者与受者的HLA-Ⅰ类分子不相容时,同时供受者HLA-Ⅰ类抗原不合,就会产生抗白血病的NK细胞异源反应性。反之如果不存在KIR独特型的不相容,即使HLA半相合,供者NK细胞由于结合抑制性配体而无法产生异源反应性[20]。Ruggeri等[21]分离供受者KIR独特型不相容供者的异源反应性NK细胞,可以裂解移植前受者来源的经PHA刺激的淋巴细胞和EB病毒转化的淋巴细胞。另外去除T淋巴细胞的干细胞移植后可以检测到早期一过性的供者型NK细胞的高峰,包括大量的供者抗受者异源反应性NK细胞,并可以持续到移植后4个月以上。同种异体反应性NK细胞具有强的GVL作用却不会引起GVHD的发生。非造血组织缺乏结合和/或激活NK细胞必需__的配体,或许这些活化性配体在造血组织和非造血组织的表达差异能够解释GVL发生的同时而不会发生GVHD。Ruggeri等[22]通过输注大剂量纯化的宿主反应性NK细胞给致死性照射后的鼠,未见GVHD发生。随后研究发现异源反应性的NK细胞可以杀伤宿主的抗原递呈细胞(antigenpresentcells,APC)从而抑制GVHD的发生,而且允许20倍异基因T细胞输注剂量的安全。Koehl等[23]对3例多次复发的ALL和AML儿童行干细胞移植后反复输注纯化的KIR不合的NK细胞,在移植后1月内3例患儿达完全缓解和完全供者型,未发现明显毒副作用及GVHD发生。NK细胞的异源反应性不会攻击除淋巴造血细胞以外的组织细胞,这使得移植前的异源反应性NK细胞输注用作受者预处理是安全的。Ruggeri等[22]发现将杂交小鼠H2d/b的同种异体反应性4×106NK细胞,输注给非致死量照射的H-2b/b小鼠,可以使H2d/b小鼠的骨髓细胞顺利植入。而未输注杂交H2d/b鼠的同种异体反应性NK细胞的H-2b/b鼠排斥H2d/b鼠骨髓细胞不能植入。这个试验证实异体反应性NK细胞在GVH中的作用可以起到足够的免疫抑制帮助植入而无GVHD发生。因此可以使半相合非清髓移植无需使用严重的免疫抑制的预处理而成功植入。2.5抗CD抗体活化NK细胞NK细胞除接受KAR和KIR的配体信号使之处于活化或非活化状态外,尚可接受其他活化信号的作用,其中CD分子就是一组可以挖掘的分子,以寻求活化整体NK细胞或清除部分单核细胞后对抗癌、抗病毒或抗自身免疫状态的作用[24]。2.6同种异体NK细胞系的治疗意义目前在NK抗肿瘤研究中已经建立了人NK-92,NKL,YT,NK3.3等NK细胞系,NK-92是唯一进入临床研究的细胞系。研究发现NK-92几乎完全缺乏KIRs表达,却保留有穿孔素和颗粒酶B介导的细胞毒作用。在体外对多种恶性疾病和异种移植的SCID小鼠中发挥重要的抗肿瘤活性[25]。国内的很多学者致力于从NK细胞肿瘤中筛选细胞株,在体外培养条件下进行某些细胞因子(SCF,IL-15,IL-12,IL-18,IL-21等)的基因转染,形成新型治疗方案,对相关疾病的生物治疗有重要意义。3.1NK细胞系NK细胞属于体积较大的异质性的淋巴细胞群体，在免疫监视、免疫防御中起着十分重要的作用。随着细胞克隆化技术的不断成熟，相继报道的NK细胞系有许多，但是只有6种来自NK细胞瘤的NK细胞系是定性的，它们是经过单克隆化、可以永久生存的大颗粒淋巴细胞，含有嗜苯胺蓝颗粒，胚系TCR基因，其免疫表型为CD1-，CD2+，sCD3-（2/2arecyCD3e+），CD4-，CD5-，CD7+，CD8-（1/1isCD8a+），CD16-，CD25+，CD28+/-，CD56+，CD57-，CD122+，CD132+，TCRab-，TCRgd-。3.1.1正常NK细胞来源的NK细胞系NK3.3为IL-2依赖型，具有很强的自然杀伤活性，可以杀伤NK敏感靶细胞K562，MOLT-4，HSB-2，CEM，BUC，Daudi。其表型为9.6E+，3A1+，HLA-DA+，T200+，T10+T3/Leu4-，T8/Leu2a-，T4/Leu3a-，Leu7-[6]。3.1.2恶性变细胞来源的NK细胞系（表1[7）]NK-92细胞是1992年建立的来自非何杰金淋巴瘤患者的NK细胞系，由于其免疫表型为CD56brightCD16-，无ADCC效应，类似于外周血CD56brightNK细胞。NK-92是唯一进入临床研究的细胞系。NK-92对不同来源肿瘤的细胞系，如白血病、淋巴瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌等，NK-92都表现出高效的杀伤活性。研究发现NK-92表达大量的活化受体，如：NKp30、NKp46、2B4、NKG2D、E、CD28，而抑制受体的表达却极少，只有NKGA/B和低水平的KIR2DL4与ILT-2，缺乏大多数正常NK细胞克隆表达的KIRs，如p58复合体（p58复合体通过结合靶细胞上的HLA抗原而抑制NK细胞的杀伤）[7]，却保留有穿孔素和颗粒酶B介导的细胞毒作用。在体外对多种恶性疾病和异种移植的SCID小鼠中发挥重要的抗肿瘤活性。为了使NK-92更适于临床应用，Nagashima等[8]又成功将IL-2基因转染到NK-92细胞中，建立了非IL-2依赖的NK细胞，并通过体内外实验证明基因修饰的NK-92细胞的细胞毒效应明显高于IL-2依赖的亲代NK-92细胞，对建立的肝转移癌小鼠也有较强的抗瘤作用。EBV+的NK细胞系HANK-1、NK-YS、SNK-6的建立有利于探讨EBV在鼻部T／NK细胞淋巴瘤发病机制中所起的作用。CD21是已知唯一的病毒受体，Kaneko等[9]从一例鼻部T／NK细胞淋巴瘤细胞中以及正常的NK细胞中均检测到CD21的表达，但SNK-6和NK-YS却不表达CD21受体抗原。因此这两种细胞系的建立还将有利于研究EBV感染NK细胞的途径以及CD21在病毒感染NK细胞过程中所起的作用。3.2NK细胞抗肿瘤NK细胞是先天性免疫系统的重要组成部分，是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞。与T淋巴细胞不同，NK细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。一般认为NK细胞只在肿瘤早期或肿瘤细胞数量少时发挥作用，肿瘤晚期或有大量瘤细胞时难以奏效。NK细胞具有较广的抗瘤谱。可杀伤同系、同种或异种瘤细胞，其杀伤靶细胞的机制可能是：（1）释放穿孔素和颗粒酶引起靶细胞坏死或凋亡。NK细胞和肿瘤细胞接触几分钟后，细胞毒性颗粒的内容物被释放到NK细胞和肿瘤细胞间的裂隙，这些##NK细胞发育分化研究取得较大进展，除骨髓、外周血和脾脏外，胸腺、肝脏、淋巴结等器官中NK细胞前体细胞(NKprecursors，NKPs)的分化及其迁移特性引起极大关注。人类CD56晡咖NK细胞易于在次级淋巴组织及非淋巴组织中聚集，而CD56“”NK细胞则能够趋化招募至外周炎症部位。NK细胞活化受体包括细胞因子受体、膜整合素分子、天然细胞毒受体、免疫球蛋白样杀伤受体，以及新发现的许多识别分子。在肿瘤的发生发展过程中，NK细胞既可以通过“内识别”方式直接识别恶性转化的癌细胞并被活化，也可以在辅助细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)的作用下被活化。DC细胞可以触发NK细胞的活化，其中IL-15R-IL-15的反式信号转导极其重要。NK细胞的肿瘤生物治疗取得了较大进展，其中基于NK细胞天然免疫识别的肿瘤生物治疗有很多新的途径。