non-codingRNA现代分子生物学课程ppt

海南大学园艺园林学院RNA的研究进展RNA组学：通过对RNA的研究所取得的巨大成果而形成了RNA组。RNA研究已有百余年的历史，其间有两个阶段时期。第一个阶段：20世纪的50～60年代，各种RNA开始被发现，但对RNA的认识还不深入。第二个阶段：20世纪的80年代，RNA的功能逐渐被发现，越来越多的研究表明RNA在遗传方面的重要作用。Non-codingRNA（非编码RNA）非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA。其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和microRNA等多种已知功能的RNA，还包括未知功能的RNA。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，在RNA水平上就能行使各自的生物学功能了。分类非编码RNA从长度上来划分可以分为3类：小于50nt，包括microRNA，siRNA，piRNA；50nt到500nt，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA等等；大于500nt，包括长的mRNA-like的非编码RNA，长的不带polyA尾巴的非编码RNA等等。根据亚细胞定位可将非编码RNA分为：细胞核非编码RNA与细胞质非编码RNA。根据是否具有polyA尾结构可将非编码RNA分为具有polyA尾的非编码RNA(polyA-plusncRNAs)和不具有polyA尾的非编码RNA(polyA-minusncRNAs。根据转录本的长度可将非编码RNA分为小非编码RNA和长链非编码RNA。分类根据生物学功能可将非编码RNA分为：持家非编码RNA和调控性非编码RNA。持家非编码RNA主要包括核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、引导RNA(gRNA)和端粒酶RNA;调控性非编码RNA主要包括小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、与Piwi蛋白相互作用的piRNA和长链非编码RNA(lncRNAs)。分类调控非编码RNA：长链非编码RNA（lncRNA）短链非编码RNA（siRNA、miRNA、piRNA）非编码RNA看家非编码RNA调控非编码RNA长链非编码RNA（lncRNA）长链非编码RNA通常是指长度大于200个核苷酸的非编码RNA转录本。该概念是在2002年由日本科学家首次提出,他们在小鼠全长cDNA文库的大规模测序中,鉴定了大量较长的非编码RNA转录本。短链非编码RNA（siRNA、miRNA、piRNA）它们的转录本序列都比较短，不超过40nt短链非编码RNA分子虽小，却参与了包括细胞增殖、分化、凋亡、细胞代谢以及机体免疫在内的几乎所有生命活动的调节和控制，在生命体内扮演着至关重要的角色。长链非编码RNA（lncRNA）lncRNA不参与或很少参与蛋白编码功能,位于细胞核内或胞浆内。近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默、染色体修饰和基因组修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等过程，其调控作用正在被越来越多的人研究。1.编码蛋白的基因上游启动子区转录，干扰下游基因的表达；2.抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因的表达；3.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；5.与特定蛋白质结合，lncRNA转录本可调节相应蛋白的活性；6.作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；7.结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定位；8.作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子。RNA(smallnoncodingRNA)miRNA(microRNA)siRNA(smallinterferingRNA)piRNA(piwi-interactingRNA)esiRNA(endogenoussiRNA)siRNAsiRNA:是一类外源性的双链小分子RNA，它的长度一般为21~25nt。它在RNA干扰途径中通过引导目的基因mRNA的降解，以抑制mRNA的表达。siRNA也可经由多种不同转染（transfection）技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的基因敲除（knockdown）效果，这使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。miRNA概念：miRNA是长约21∼25nt的单链RNA,其中50%定位于易发生结构改变的染色体区域。特点：miRNA是内源性的,是生物体基因的表达产物;miRNA是由不完整的发卡状双链RNA,经Drosha和Dicer酶加工而成。piRNApiRNA是近年来在哺乳动物细胞内发现的长度约为24∼31nt的RNA分子,因在生理状态下能与piwi蛋白偶联,故命名piRNA。由于Piwi为一表观遗传学调控因子,能与PcG蛋白共同结合于基因组PcG应答元件上,协助PcG沉默同源异型基因,因此推测与Piwi相关的piRNA也应具有表观遗传学的调控作用piRNA的形成及扩增piRNA前体与piwi蛋白结合后，能在u位点进行切割形成piRNA反义链，piRNA反义链能与转座子识别，并使切割后的转座子与AGO3蛋白结合，从而进一步对转座子进行修饰切割，切割后的转座子可以与piRNA前体结合，并且在U位点切割前体，从而使切割后的前体与piwi蛋白结合，进过剪切修饰形成PiRNA和PiRNA与Piwi蛋白结合的复合体，从而使PiRNA数量增多。非编码RNA的比较种类长度（nt）来源主要功能siRNA~21~25长双链RNA转录基因沉默miRNA~21~25含发卡结构的pri-miRNA转录基因沉默piRNA~24~31长单链前体或起始转录产物等多途径生殖细胞内转座子的沉默lncRNA200多种途径基因组印记和X染色体失活非编码RNA的作用1.影响染色体的结构2.调控转录3.参与RNA的加工、修饰4.参与mRNA的稳定和翻译调控过程5.影响蛋白质的稳定和转运6.在植物适应环境胁迫中的调控作用7.在细胞发育和分化中的调控作用非编码RNA的检测技术cDNA克隆策略实时荧光定量（RT-PCR技术）SAGE技术微阵列芯片检测技术Solexa测序法表面增强拉曼光谱法cDNA克隆策略长度在20～500bp的RNA大多为非编码RNA。非编码RNA可将由变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离到的非编码RNA进行逆转录后加上接头，并克隆到标准载体中构建cDNA文库。为防止5'端丢失常在3′端加上C-尾巴，在T4RNA连接酶的作用下连上寡聚核苷酸接头，最后对连接产物进行RT-PCR扩增。cDNA克隆策略可鉴别已知的高丰度非编码RNA，如tRNAs或小核糖体RNA。实时荧光定量（RT-PCR技术）实时荧光定量PCR技术是一种高通量、灵敏的基因表达检测技术，常用于蛋白编码基因表达检测，也被广泛地应用于microRNA或其他非编码RNA的表达检测。通过该技术，可定量监测目的基因的表达情况，筛选生物学功能相关的非编码RNA。SAGE技术SAGE是一种高通量的研究技术，通过逆转录得到cDNA,从而获得SAGE双标签,然后,通过连接、扩增双标签片段并进行克隆、测序，以同一标签在某组织中出现的频率，反映该标签所代表的基因在该组织中的表达丰度。与微阵列芯片技术相比，SAGE可在未知任何基因或EST序列的情况下，对靶细胞进行研究，具有显著的优越性。微阵列芯片检测技术微阵列芯片以高密度阵列为特征，在微阵列上固定大量探针分子，并将标记样本与微阵列探针进行杂交。通过检测杂交信号的强度，研究不同样本中特异基因的表达丰度，从而较为全面地比较不同样本中基因表达水平的差异。被广泛用于mRNA的研究，也被用于非编码RNA的发现与表达分析。Solexa测序法Solexa测序法是新发明并迅速得到广泛应用的一种高通量基因表达检测技术，该方法是利用单分子阵列来测定基因的表达情况。首先，将核酸从细胞中提取，将其片段化为100～200碱基大小，分别连上接头，经接头引物的PCR扩增后制成文库；然后，将已加入接头的核酸片段固定在含有接头的芯片上，经反应后，将不同片段扩增。在每个循环中，利用边合成边测序的原理，在单分子阵列中加入4种荧光标记染料的核苷和聚合酶，在酶的作用下，每个单链DNA分子通过互补碱基的配对被延伸，通过CCD采集荧光信号，快速扫描整个阵列，检测特定的结合在每个片段上的碱基，从而进行基因转录本的测序。尽管Solexa测序技术以高效率、高精确鉴定miRNA著称，但相对于传统、普遍使用的miRNA定量方法还存在一定的不足，这可能是由于测序深度不足，或一些microRNA存在特殊修饰而带来的问题。表面增强拉曼光谱法（SERS）利用水的拉曼散射很微弱这一特点，高灵敏度和特异性的SERS检测技术逐渐成为研究水相中的生物和化学样品的理想工具，应用于病毒、细菌、蛋白和核酸等生物样品的检测。克隆非编码RNA的方法基因克隆法蛋白质-RNA复合物分离法基因克隆法小鼠脑→组织匀浆→提取总RNA→8%PAGE回收50-110nt（fractionalⅠ）和110-500nt（fractional）→Poly(A)聚合酶加尾→cDNApSPORTI→PCR→高密度陈列→杂交除去高丰度已知的小RNA→未杂交的cDNA测序。蛋白质-RNA复合物分离法分离蛋白质-RNA复合物，除去蛋白质，纯化RNA分子，反转录cDNA，克隆、测序、结果分析。所得RNA的cDNA分子必须进行Northern杂交，除去断裂的小RNA。microRNA2001年命名为microRNA2002年入选为science年度十大发现之首MicroRNAmicroRNA（简称miRNA）是一种非编码小RNA分子（约含22个核苷酸，19~25）存在于植物，动物和一些病毒中，其功能在RNA沉默和基因表达的转录后调控。miRNA的特点单链RNA19~25nt，非编码RNA单一的目标miRNA可能靶向数百个基因抑制翻译（动物）或降解靶RNA（植物）对细胞的增殖、分化、凋亡、癌变及病毒感染起调控作用保守性进化453.miRNA的鉴定方法和标准2.miRNA的作用机理1.miRNA的产生和特点463.miRNA的鉴定方法和标准2.miRNA的作用机理1.miRNA的产生和特点47第一节miRNA的产生和特点miRNA的产生：植物miRNA的形成包括miRNA基因转录、加工成熟和功能复合体组配三个过程。miRNA基因转录：通过RNA聚合酶Ⅱ转录在细胞核中形成初级转录本，称为primarymiRNAs（pri-miRNAs）。植物的pri-miRNA通常由腺苷酸开头，具有5'帽子和3'-polyA尾，位于一个保守的TATA-box序列的下游40个核苷酸序列处。48第一节miRNA的产生和特点加工成熟：植物miRNA的加工成熟过程是由存在细胞核内的Dicer酶类似物，在HYL1蛋白的协助下，以一种ATP依赖的方式，通过两次剪切步骤生成。第一次剪切pri-miRNA后，产生具有茎环二级结构的pre-miRNA，接着在两个蛋白酶HYL1和SERRATE的协助下再次切割pre-miRNA，将miRNA/miRNA*二聚体从pre-miRNA茎环结构的“茎”上剪切下来。miRNA基因在细胞核中经由RNA聚合酶II进行转录、DCL1剪切后和HEN1介导的甲基化后，由转运蛋白家族中的核质转运蛋白HASTY（HST）从细胞核转运到细胞质中。49第一节miRNA的产生和特点功能复合体组配：miRNA/miRNA*二聚体中miRNA链在SDN的诱导下装载进入RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），成熟miRNA与ARGONAUTE1（AGO1）蛋白结合，形成非对称的RISC，而miRNA*则被降解。miRNA引导RI