Notch信号通路在缺血再灌注条件下肠粘膜上皮细胞凋亡中的调控作用--杨桦

作者单位：400037重庆，第三军医大学新桥医院普通外科，通讯作者：杨桦，Email:[e-mail]基金项目：国家自然科学基金重点项目(NSFC81330013)，国家自然科学基金面上项目(NSFC81272078),国家教育部创新团队项目基金（教技函[2013]59号）Notch信号通路在缺血再灌注条件下肠粘膜上皮细胞凋亡中的调控作用陈国庆，张治草，程应东、肖卫东，邱远，王文生，杜广胜，古应超，李祥生，杨桦**通讯作者摘要：目的：明确Notch信号通路在肠道缺血再灌注条件下肠粘膜上皮细胞凋亡中的调控作用。方法：建立雄性C57BL/6小鼠的肠道缺血再灌注动物模型，12h后取肠组织标本。TUNEL方法检测肠粘膜上皮细胞的凋亡水平。Realtime-PCR及Western-blot方法检测肠粘膜上皮细胞Notch信号通路各组分的表达变化。建立体外IEC-6细胞的缺氧/复氧细胞模型，通过阻断剂DAPT及siRNA技术明确Notch信号通路在肠粘膜上皮细胞凋亡中的作用。结果：肠缺血再灌注后，小鼠肠粘膜上皮细胞的凋亡水平明显升高，与此同时肠粘膜上皮细胞内Notch信号通路Jagged1、DLL1、Notch2及Hes5的mRNA及蛋白表达水平均明显升高。在体外IEC-6细胞的缺氧/复氧模型中，缺氧/复氧刺激促进了IEC-6细胞的凋亡，而阻断Notch信号通路的表达后，IEC-6细胞的凋亡水平进一步明显升高。结论：在肠道缺血再灌注条件下肠粘膜上皮细胞中的Notch信号通路被激活，发挥抑制肠粘膜上皮细胞凋亡的作用。1.前言肠道的缺血再灌注损伤（Ischemiareperfusioninjury,I/R）可导致全身炎症反应综合征、脓毒血症及多脏器功能障碍综合征。肠道是多脏器功能障碍综合征的“发动机”，而肠粘膜屏障功能的损伤被认为是其内在的始发事件[1]。既往研究已明确，肠道I/R可导致肠粘膜上皮细胞的凋亡，进而引起肠粘膜屏障功能的损伤[2-4]。信号通路PI3K/AKT，ERK1/2及HIF-1通路均参与了肠道I/R导致的肠粘膜上皮细胞的凋亡[5-7]。但是肠道I/R条件下肠粘膜上皮细胞凋亡的调控机制仍未完全明确。既往研究明确，Notch信号通路在肠粘膜上皮稳态的维持中发挥重要调控作用[8]。在哺乳动物中，Notch信号通路组分有四种Notch受体（Notch1-4）、五种配体（Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3、DLL4）[9,10]。配体与细胞膜表面的Notch受体相互结合，激活了Notch受体的酶切反应，Notch受体释放酶切后的活性片段NICD进入胞浆，NICD由胞浆进入胞核形成转录激活复合物，并激活相应的目的基因Hes家族及Hey家族基因[11]。γ分泌酶参与了Notch受体的酶切反应，抑制γ分泌酶的活性可抑制Notch受体的激活[12]。研究发现，在肝脏的I/R损伤中，Notch2-Hes5信号通路具有抑制I/R损伤导致的肝脏细胞凋亡的作用[13]。另外，Notch信号通路可抑制损伤导致的心肌细胞、内皮细胞和淋巴细胞的凋亡[14-16]。Notch信号通路还可抑制I/R损伤导致的神经细胞及间质细胞的凋亡[17,18]。肠道缺血再灌注损伤后，肠粘膜上皮细胞发生增殖及凋亡反应[2-4]。在此前的研究中，我们发现肠道I/R损伤可导致肠粘膜上皮Notch信号通路的激活，参与了I/R损伤后肠粘膜上皮细胞的增殖[19]。然而，Notch信号通路是否参与了肠I/R损伤后肠粘膜上皮细胞的凋亡，尚不明确。本研究拟明确，肠道I/R损伤后Notch信号通路在肠粘膜上皮细胞凋亡中的调控作用。2、材料与方法2.1实验动物本研究中使用C57BL/6小鼠、6-8周龄、雄性，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心。作者单位：400037重庆，第三军医大学新桥医院普通外科，通讯作者：杨桦，Email:[e-mail]基金项目：国家自然科学基金重点项目(NSFC81330013)，国家自然科学基金面上项目(NSFC81272078),国家教育部创新团队项目基金（教技函[2013]59号）所有小鼠随机分为2组，对照组（n=7）及I/R实验组（n=7）。肠I/R小鼠模型的建立方法为微创血管夹夹闭肠系膜上动脉20min，之后松开血管夹关闭腹壁切口，12h后处死动物，取空肠组织备用[19]。2.2细胞培养肠粘膜上皮细胞IEC-6购买于美国ATCC公司。IEC-6培养于DMEM培养基，加入10%胎牛血清，100ug/ml链霉素及100IU/ml青霉素。细胞贴壁后继续于常氧条件（20%O2,5%CO2）或缺氧条件下（1%O2，5%CO2）。需要阻断Notch通路激活时，培养基中加入DAPT干预12h，此后流式细胞学技术检测IEC-6细胞的凋亡水平。2.3Real-timePCR实验Trizol法提取肠粘膜的总RNA，逆转录为cDNA后保存备用[32]。在体内实验中，具体引物序列如下：Jagged1，正义链,5'-CTTGGGTCTGTTGCTTGGTGA-3'反义链,5'-ACATTGTTGGTGGTGTTGTCCTC-3';DLL1正义链,5'-CGGCTTCTATGGCAAGGTCTG-3'反义链,5'-TGTAGCCTCCGTCAGGGTTATCT-3';Notch2正义链,5'-GCGAGCACCCATACCTGACA-3'反义链,5'-TGGGCTGGTGGTCACATCTG-3';Hes5正义链,5'-AAGCTGGAGAAGGCCGACA-3'反义链,5'-CAGGAGTAGCCCTCGCTGTAGT-3';GAPDH正义链,5'-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCA-3'反义链,5'-AGGTGGAAGAGTGGGAGTTGC-3'.在体外研究中，具体引物序列如下：Jagged1正义链,5'-CGCCGTGCCCTTTGTGGAG-3'反义链,5'-GGGCCAGACTGCAGGATAAAC-3';DLL1正义链,5'-AGAGGGGCCAACGCTACATGTG-3'反义链,5'-GGCGGAGGCTGGTGTTTCTG-3';Notch2正义链,5'-GGGGGGACCTGCTCTGACTAC-3'反义链,5'-ACGTGCCGCCATTGAAACAGGAG-3';Hes5正义链,5'-GAAGCCGGTGGTGGAGAAG-3'反义链,5'-CGGCGAAGGCTTTGCTGTG-3';GAPDH正义链,5'-GGGGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3'反义链,5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3';Real-timePCR的具体反应条件为：94°C反应10min,94°C持续30s,60°C持续30s,72°C持续45s，反应45循环。2.4Westernblot实验RIPA法提取组织及细胞的总蛋白，bradford法检测蛋白总浓度，保证电泳胶上样总量一致，电泳完成后蛋白转膜至PVDF膜，室温下5%脱脂奶粉封闭1h，4°C冰箱孵育一抗过夜。相关一抗如下：NICD2(ab-52302,Abcam,美国),Hes5(sc-25395,SantaCruz,美国),GAPDH(sc-32233,Santa-Cruz,美国)，一抗孵育完成后室温下孵育相应二抗1h，曝光显色，并利用柯达凝胶成像分析系统进行半定量分析（carestream，美国）。2.5siRNA法干扰细胞Hes5表达在体外研究中，为了阻断IEC-6细胞内Notch信号通路，我们采用了siRNA干扰技术抑制IEC-6细胞Hes5的表达水平。SiRNA干扰序列购买自广州锐博公司，Hes5相应的siRNA序列如下：siRNA1,正义链5'GCAUUGAGCAGCUGAAACUdTdT3'反义链3'dTdTCGUAACUCGUCGACUUUGA5';siRNA2,正义链5'GCAGAUGAAGCUGCUUUACdTdT3'反义链3'dTdTCGUCUACUUCGACGAAAUG5'。IEC-6细胞培养于6孔板，铺满板底约50%-60%时进行siRNA干扰实验，干扰siRNA浓度为50nmol，按照操作说明，对照siRNA（si-NC）作为阴性对照组[19]。干扰6h后，吸除干扰试剂，替换为正常IEC-6细胞培养基，继续培养48h，提取细胞总蛋白进行后续的Wester作者单位：400037重庆，第三军医大学新桥医院普通外科，通讯作者：杨桦，Email:[e-mail]基金项目：国家自然科学基金重点项目(NSFC81330013)，国家自然科学基金面上项目(NSFC81272078),国家教育部创新团队项目基金（教技函[2013]59号）nblot实验，或者流式细胞学技术检测IEC-6细胞的凋亡水平变化。2.6TUNEL法检测上皮细胞的凋亡肠组织标本固定于4%多聚甲醛，制备5um厚度切片，TUNEL试剂盒（罗氏，德国）检测肠上皮细胞的凋亡水平变化。按照操作说明，室温下切片浸泡于20ug/ml蛋白酶K15min，0.1%浓度TritonX-100孵育8min，PBS冲洗，3%双氧水浸泡切片灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗后切片标本表面滴加50ulTUNEL试剂，37°C孵育60min，PBS冲洗后荧光显微镜下观察显色情况，之后行DAB显色，苏木素复染，光学显微镜下观察阳性染色细胞。在体外实验中，我们采用流式细胞学技术检测IEC-6细胞的凋亡水平。按照此前的操作方法，IEC-6细胞培养或干预后，行FITC-AnnexinV及PI双染，流式细胞仪检测细胞的凋亡水平[34]。2.7统计学分析所有数据均为均数±标准差。两组间的均数比较采用Student’s检测，多组间的均数比较采用ANOVA检测。所有的统计学分析均采用SPSS13.0完成，p0.05具有统计学差异。3.结果3.1肠道缺血再灌注促进了肠粘膜上皮细胞的凋亡通过阻断肠系膜上动脉20min，我们建立了小鼠的I/R动物模型，12h后取空肠组织备用，TUNEL法检测肠粘膜上皮细胞的凋亡水平。结果显示，肠道I/R明显促进了肠粘膜上皮细胞的凋亡（图1A/B）。统计分析表明，I/R组肠上皮细胞的凋亡水平是对照组的18.7倍（图1B），阴性对照组无阳性染色细胞（图1A）。图1.肠道I/R损伤促进了肠粘膜上皮细胞的增殖。A.阳性染色细胞（DAB棕色）主要位于肠粘膜上皮（×200），右侧为左侧矩形框内的放大图片（×400）。B.I/R组肠粘膜上皮细胞凋亡明显增生，**与对照组相比P0.01。3.2肠道I/R激活了肠粘膜上皮内的Notch信号通路既往研究明确，在小鼠肠粘膜上皮细胞内主要表达的Notch信号通路组分包括：4种配体（Jagged1，Jagged2，DLL1，DLL4），4种受体（Notch1-4），4种Hes下游基因（Hes1，Hes5，Hes6，Hes7）[20]。我们首先采用了Real-time方法筛查Notch信号通路基因的表达水平变化，结果表明I/R促进了肠粘膜上皮Jagged1，DLL1，Notch2及Hes5表达，与对照组相作者单位：400037重庆，第三军医大学新桥医院普通外科，通讯作者：杨桦，Email:[e-mail]基金项目：国家自然科学基金重点项目(NSFC81330013)，国家自然科学基金面上项目(NSFC81272078),国家教育部创新团队项目基金（教技函[2013]59号）比较，分别升高了2.40倍、1.85倍、1.93倍及3.30倍（图2A，P0.01）。接下来，我们检测了相应基因的蛋白表达水平。统计学分析表明，I/R肠粘膜上皮细胞内Hes5及NICD2蛋白表达水平分别是对照组的3.25及2.30倍（图2B/C，P0.01）图2.肠I/R促进了肠粘膜上皮内Notch信号通路mRNA及蛋白的表达。A.建立I/R小鼠模型，取肠粘膜提取总RNA，行Real-timePCR检测。I/R促进了肠粘膜上皮内Jagged1，D