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OasisHLB固相萃取-超快速液相-三重四极杆质谱法测定花生和花生油中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2劳哲，江恩源，（梧州市疾病预防控制中心广西梧州543002）摘要：目的建立了OasisHLB固相萃取-超快速液相-三重四极杆质谱法测定花生和花生油中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法。方法样品用甲醇-水（V:V=20:80）提取，离心后过OasisHLB柱萃取净化，超快速液相进行梯度洗脱，质谱用电喷雾离子源（ESI）,经过正离子MRM模式，外标法定量。结果黄曲霉毒素(AFT)B1、B2、G1、G2的最低检出限分别为：0.05、0.05、0.10、0.20μg/kg，平均加标回收率在89.3%～98.7%之间，精密度（RSD）在2.6%～5.3%之间。结论本法利用OasisHLB固相萃取柱良好的性能和质谱仪采用弯曲180度的碰撞池技术大大减少了样品中的杂质干扰，精密度和准确度高，方法操作简便，结果可靠。关键词：超快速液相；三重四极杆质谱；OasisHLB固相萃取；黄曲霉毒素DeterminationofAflatoxinB1,B2,G1,G2inPeanutandPeanutOilbyOasisHLBSPE-UltraFastLiquidChromatography-TripleQuadrupoleTandemMassSpectrometryLAOZhe，JIANGEn-yuan(CenterforDiseaseControlandPreventionofWuZhou，GuangxiWuzhou，543002)ABSTRACT:ObjectiveAmethodforDeterminationofaflatoxinB1,B2,G1,G2inpe-anutandpeanutoilbyoasisHLBSPE-highperformanceliquidchromatography-triplequa-drupoletandemmasswasestablished.MethodsThesampleundergoesmethanol-water(V:V=20:80)extraction,extractionpurificationthroughOasisHLBCartridgeaftercentrifugat-ion.Gradientelutionofliquidchromatography,ESIisappliedasmassspectrum,whichissubjecttopositiveionMRMmodeandquantitationwithexternalstandardmethod.TheminimumdetectionlimitforAFTB1,B2,G1andG2arerespectively:0.05,0.05,0.10and0.20ng/mL.Resultstheaveragerecoveryrateofstandardadditionis89.3%～98.7%,RSDis2.6%～5.3%.ConclusionsByoptimizingsampleextractionconditions,precisionextra-ctionofOasisHLBSPEandcollisioncellwitha180degreeareadoptedtogreatlyredu-cetheimpurityinterferenceinthesample,andincreaseprecisionandaccuracy.Itcanob-tainreliableresultswithsimpleoperation.KEYWORDS:ultrafastliquidchromatography;triplequadrupoletandemmassspectrometry;OasisHLBsolidphaseextraction;aflatoxin黄曲霉毒素(AFT)是食物及饲料中寄生的黄曲霉、寄生曲霉代谢的化学结构类似的一组产物，在潮湿温热地区出机率最高。它含有双呋喃环和氧杂萘邻酮，双呋喃环为基本毒性结构，氧杂萘邻酮与致癌性有关。接触浓度高时可导致肝癌甚至死亡。目前，测定食品中AFT的方法有酶联免疫法[1]、薄层层析法[2]、微柱筛选法[3]、免疫层析法[4]、金标试纸法[5]、免疫亲和柱净化液相色谱法[6]、液相色谱-质谱法[7]等。国家标准GB/T5009.24-2011中推荐的检测方法是的薄层色谱法和微柱筛选法[8]。酶联免疫法操作的人为误差较大,主要应用于样品筛选和定性分析。薄层层析法和免疫层析法需要人工制作层析板，要手动进行点板和有机溶剂展开，操作过程复杂，重现性差。金标试纸法只适合快速定性测定，定量准确度差。微柱筛选法所需的微柱层析管必须要随装随用，柱管很容易在空气中吸水导致活性下降影响吸附率，使检测结果不够稳定。免疫亲和柱净化液相色谱法由于免疫亲和柱受温度影响大，太高或太低的温度都会对亲和柱的回收率有一定的影响，而且价格较高，不适合基层单位进行大批量分析样品。OasisHLB吸附剂是由亲脂性二乙烯苯与亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成大孔共聚物。保留机理为反相，通过特殊的极性捕获基团（极性钩）增加对极性物质的保留提供良好的水浸润性。可用于中性、碱性和酸性化合物的通用型吸附剂，回收率高而稳定[9]。根据资料分析，OasisHLB固相萃取柱使用分析效果较好，价格比免疫亲和固相萃取柱便宜很多，更适合大批量检测。本文采用OasisHLB固相萃取-超快速液相-三重四极杆质谱法测定花生和花生油中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。1材料与方法1.1仪器与试剂ABSCIEXTripleQuad-3500质谱仪（带ESI离子源）；ShimadzuNexeraXR超快速液相色谱仪；WatersOasisHLB固相萃取柱（3cc，60mg）；全自动固相萃取仪（上海屹尧EXTRA）；Vortex-Genie2涡旋振荡器；Cence-H1850高速离心机；力德LAA-10-L超纯水机；氮吹浓缩仪（上海屹尧N1）；0.22μm、0.45μm滤膜+抽滤头（有机相）；乙腈（TEDIA色谱纯）、甲醇、甲酸、正己烷（Merck色谱纯）；氯化钠（西陇化工优级纯）；IKAA11研磨机；黄曲霉毒素总量免疫亲和柱（北京华安麦科生物技术有限公司）；黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准物质（农业部环境保护科研监测所SB05-195、196、197、198-2008）；黄曲霉毒素标准样品Level#AC-274；Level#AC-270（新加坡普瑞邦公司，GradePRIBOLAB,aflatoxininmaizeflouroekanalanalyticalstandard）。1.2提取准确称取5.00g研磨均匀的花生或花生油样品至50mL塑料离心管中，加入5mL正己烷、5mL超纯水、2g氯化钠充分震荡均匀后加入10mL甲醇-水（V:V=20:80）提取液，在涡旋振荡器高速震荡（300r/min）10min，以11000r/min离心5min，花生样品收集上清液（花生油样品用带针头的注射器收集下层清液）于50mL比色管中。残渣中再加入10mL提取液再提取一次，合并提取液用注射器吸取后推出通过抽滤头（0.45μm滤膜），滤出的清液备用。1.3净化过全自动固相萃取仪设定程序为：用10mL甲醇活化OasisHLB固相萃取柱，6mL纯水平衡柱子；将收集的滤出的清液经上样：10.0mL，流速：1.0mL/min；淋洗：3.0mL的甲醇-水（5:95），流速：1mL/min；用2.0mL空气吹干；洗脱：5.0mL甲醇洗脱，流速：1.0mL/min；洗脱液于定量浓缩仪内用氮气吹至近干，用1.0mL乙腈溶解，用注射器吸取后推出通过抽滤头（0.22μm滤膜），滤出液用乙腈定容至1.00ｍＬ待上机分析。1.4液相色谱条件色谱柱：Shim-packXR-ODSⅡ（75mm×2.0mm，2.2μm）；流速：1.0mL/min；进样体积：10.0μL；柱温：30℃；流动相：A为水（0.2%甲酸）；B为乙腈；梯度洗脱程序：0～2min，20%B；2～5min，20%B～95%B；5～9min，95%B；9～10min，95%B～10%B；10～12min，10%B。1.5质谱条件电喷雾离子源正离子扫描（ESI﹢）；多反应监测模式（MRM）；喷雾电压（IS）:5500V；气帘气压力（CUR）：20psi；碰撞气压力（CAD）：8psi；雾化温度（Temp）：600℃；雾化气压力（Gas1）：55psi；辅助气压力（Gas2）：60psi。黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的质谱优化条件设置见表1。表1黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的质谱优化条件设置化合物母离子/m/z子离子/m/zDP/VEP/VCE/VCXP/VAFTB1313.1285.1（目标）100103315241.0（参考）100105015AFTB2315.0259.0（目标）100104015287.0（参考）100103615AFTG1329.0243.0（目标）110103615200.1（参考）110105615AFTG2331.1313.1（目标）95103515245.1（参考）95104215备注：DP:去簇电压；CE:碰撞能；EP碰撞室入口电压；CXP：碰撞室出口电压。2结果2.1检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液得到MRM质谱图按照表1的质谱优化条件，以多反应监测模式（MRM）检测5μg/L的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准溶液得到MRM质谱图见图1。XICof+MRM(10pairs):313.100/285.100DaID:aftB12fromSample6(5)of20150519-aft.wiff(TurboSpray)Max.1.5e4cps.1.61.71.81.92.02.12.22.32.42.52.62.72.82.93.03.13.23.33.4Time,min0.01000.02000.03000.04000.05000.06000.07000.08000.09000.01.0e41.1e41.2e41.3e41.4e41.5e4Intensity,cps2.552.401.702.441.652.753.362.802.302.232.201.881.923.163.062.682.042.863.221.793.372.121.551.562.963.26B1-2.55B2-2.47G1-2.45G2-2.37图15μg/L的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准溶液MRM质谱图多反应监测模式（MRM）的工作原理是先检测具有特异性的母离子，然后只将选定的特异母离子进行诱导碰撞，去除其他子离子干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号采集。以目标离子对和参考离子对的保留时间和特异的离子质谱响应信号进行定性，以目标离子对的峰面积进行定量。黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的目标离子对的保留时间分别是：2.55min；2.47min；2.45min；2.37min。2.2检测样品待测液得到MRM质谱图按照照表1的质谱优化条件，以多反应监测模式（MRM）检测花生样品待测液得到MRM质谱图见图2。XICof+MRM(10pairs):313.100/285.100DaID:aftB12fromSample12(2-2)of20150519-aft.wiff(TurboSpray)Max.6.0e4cps.1.61.71.81.92.02.12.22.32.42.52.62.72.82.93.03.13.23.33.43.5Time,min0.05000.01.0e41.5e42.0e42.5e43.0e43.5e44.0e44.5e45.0e45.5e46.0e4Intensity,cps2.56B1-2.56B2-2.47图2花生样品的MRM质谱图以花生样品中的黄