828猪细小病毒VP2与猪圆环病毒多肽p21基因

猪细小病毒VP2与猪圆环病毒多肽p21基因的克隆及联合表达孙彦欣，左玉柱，李建辉，范京惠*（河北农业大学动物科技学院，河北保定071001）摘要：从河北省部分地区病猪中分离猪细小病毒，通过RT-PCR技术获得扩增VP2蛋白的编码基因，采用PCR技术对猪圆环病毒的多肽P21基因进行扩增。分别将其连入Simple-T载体中，经酶切，PCR及序列测定法进行鉴定。测序正确后，将VP2基因与多肽P21基因插入到pET-32a（+）载体中构建原核表达载体。将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，并用IPTG诱导，将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot检测到分子量大小为85kd的目的蛋白，结果显示VP2基因与P21基因可以在大肠杆菌中获联合表达。Western-blot试验证明，该蛋白可以与猪细小病毒免疫血清产生特异性结合反应，具有良好的抗原性，为构建二联基因工程疫苗提供重要物质基础。关键词：猪细小病毒；VP2基因；P21基因；原核表达CloningandexpressionofProcineparvovirusandP21PolypeptideofPorcinecireovirustype2Sunyanxin，ZUOYu-zhu，LIjianhui,FANJing-hui*（CollegeofAnimalScienceandTechnology,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding071000,China）Abstract:ProcineparvovirusderivedfromdiseasedswinesinsomeareasofHebeiProvince,ThespecificVP2geneamplifiedbyRT-PCRwasclonedintoSimple-Tvector.apairofprimersweredesignedaccordingtoDNAfragmentofP21PolypeptideofPorcinecireovirustype2,subsequentP21encodinggenewasamplifiedthroughPCRandwasclonedintoSimple-Tvector.andidentifieditthroughdigestedwithrestrictionendoucleases,PCRandsequenceanalysismethods.Aftersequencingexactly,TheVP2/P21genesequencewasclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET-32a(+)andtherecombinanttransformedintoE.colicellBL21.SDS-PAGEandWestern-blot.indicatedthattherecombinantfusionproteinwasabout85kd,TheresultshaveshownthatVP2/P21genewashighlyexpressedinE.coliandproteinwasconsistentedwiththeexpectedmolecularweight.Andthewestern-blotexperimenthasdemonstratedthattheproteincanhavespecificbindingreactionwithProcineparvovirusantiserum.Thisstudycanprovideabasisfordevelopingageneticallyengineeredvaccinecandidateagainstppv/pcv2.Keywords:Procineparvovirus;VP2gene;Porcinecireovirustype2;prokaryoticexpression猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)是一种自我复制的细小病毒，主要引起初产母猪的繁殖障碍[1]。PPV单纯感染猪以外，该病毒与猪圆环病毒(PorcineCircoviusType2，PCV2)的混合感染更为普遍。目前这两种传染病在猪场并发或继发感染现象较为普遍，给养猪业造成了巨大的经济损失。猪细小病毒是一种自主复制性DNA病毒，其基因组编码2种结构多肽（VP1和VP2）及3种非结构蛋白NS1,NS2和NS3，其中VP2核衣壳蛋白是PPV的主要保护性抗原，而且具有很高的保守性[2]。Martinez等，于1992将PPVVP2基因克隆到杆状病毒表达系统中，在昆虫细胞中表达时发现，VP2基因不仅能在昆虫细胞中高效表达，而且表达的蛋白能自我装配成类病毒粒子，用其免疫母猪后，能诱导产生与猪细小病毒相似的免疫应答。[3]VP2基因在体外表达的蛋白形成的类病毒粒子的高效免疫原性，以及VP2基因的高度保守性，都表明VP2基因所表达的类病毒粒子是作为诊断和预防此病的良好抗原物质。基金项目：作者简介：孙彦欣（1983-）河北保定人，河北农业大学预防兽医学硕士研究生，主要从事猪传染病病原学及防治研究，Email:[e-mail]；电话:[phone]范京惠为通讯作者，主要从事兽医微生物与免疫学研究，Email:[e-mail].目前，学者们分别对PCV2基因组各开放阅读框（ORFs）及其编码蛋白的结构和功能进行了研究，并对各蛋白的细胞表位进行了测定，Stevenson等研究表明，位于ORF1内201-220位氨基酸的多肽P21，为一免疫优势T细胞表位[4]，免疫动物后，动物体内的淋巴细胞明显增多，而且免疫动物血清中PCV2特异的抗体水平亦明显升高。Mahe等研究结果显示，位于ORF1内185-211位氨基酸的多肽P4(与P21共享201-211氨基酸)内存在一个B细胞表位[5]。以上研究结果提示，多肽P21内存在PCV2特异的优势抗原表位，是研制抗原表位疫苗的首选目标表位。本研究利用大肠杆菌表达系统，对VP2基因以及多肽p21基因进行克隆并进行了表达，为二联基因工程疫苗研制奠定了基础。1材料与方法1.1材料：1.11菌株、病毒株及质粒：pET-32a-vp2-p21质粒，含有猪细小病毒VP2基因，5’端插入猪圆环病免疫优势T细胞表位P21多肽基因，由本实验室构建保存；原核表达载体pET-32a(+)有本实验室保存；猪细小病毒株由本实验室从河北省部分地区患猪体内分离获得；感受态E.coliDH5α、BL21；pMD18-Tsimple载体购自大连宝生物公司。1.12主要试剂和设备：TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、SalⅠ购自大连宝生物公司。Trans2KplusDNAMarker、低分子量蛋白Marker、预染蛋白Marker购自北京全是金生物技术有限公司；DNA胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司，鼠源抗PPV高免血清、鼠抗PCV2血清由本实验室制备保存;HRP标记的羊抗鼠IgG购自Promega公司。DAB显色液购自北京solarbio公司。1.13引物的设计与合成：根据GenBank发表的猪细小病毒参考毒株NADL-2株VP2基因的核苷酸序列，设计用于扩增VP2编码区基因的一对引物：上游引物YVP2:5’TCTGTCGAC（SalⅠ）ATGAGTGAAAATGTGGAAC3’下游引物ZVP2:5’AGTCTCGAG(XhoⅠ）TGATTAACCAAGTAACTGA3’根据GenBank发表的猪圆环病毒的基因核苷酸序列和位于ORF1内201-220位氨基酸的多肽P21序列，设计出一对寡核苷酸引物进行P21基因的扩增。上游引物P1：5’GGATCC（BamHⅠ）ATGGATGGATATCATGGAGAAGAAGTTGTTGTTGTTTTGGAGGA3’下游引物P2：5’GTCGAC（SalⅠ）CCAAGGTAACCAGCCATAAAAATCATCCAAAACAACAA3’1.2方法：1.2.1VP2基因片段的扩增应用上述扩增VP2编码区基因的引物，采用PCR扩增目的片段。反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min；反应结束后,PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果，得到大小为1740bp目的片段。用小量凝胶回收试剂盒进行纯化回收，并连接与pMD18-T载体，并进行酶切鉴定。1.2.2P21基因片段的扩增应用上述扩增多肽P21基因的引物采用PCR扩增目的片段。上游引物中还引入一个起始密码子ATG,并且上、下游引物之间互补重叠16bp，从而互为引物和模板，进行P21基因的扩增反应条件为：70℃加热5min；23℃或室温）退火5min，37℃延伸30min，最后70℃加热10min；反应结束后，PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果，得到大小为60bp目的片段，用小量凝胶回收试剂盒进行纯化回收，并连接与pMD18-T载体，并进行酶切鉴定。1.2.3重组表达载体的构建用SalⅠ和XhoⅠ对pMD18-T-vp2进行双酶切，用SalⅠ和XhoⅠ对表达载体pET-32a（+）进行双酶切，产生相匹配的粘性末端，然后回收纯化目的片段和载体片段，经T4DNA连接酶连接，构建重组体pET-32a（+）-vp2；然后用SalⅠ和BamHⅠ对pMD18-T-P21进行双酶切，用SalⅠ和BamHⅠ对重组体pET-32a（+）-vp2进行双酶切，产生相匹配的粘性末端，然后回收纯化目的片段和载体片段，经T4DNA连接酶连接，构建重组体pET-32a（+）-vp2-p21；并把重组体转化直大肠杆菌BL21感受态细胞后，小量质粒提取试剂盒提取重组体阳性质粒DNA，并进行PCR和酶切鉴定。1.2.4重组质粒pET-32a（+）-vp2-p21的表达及表达产物的SDS-PAGE分析将转化至大肠杆菌BL21的pET-32a（+）-vp2-p21重组质粒以及pET-32a（+）空载体，分别转接于含Amp(100μg/mL)的LB培养基中，200r/min振摇培养过夜，次日按1︰100转接于含Amp的50mLLB培养基中,37℃振摇培养至对数生长期((D600nm=0.6～1.0)，加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG，在28℃振摇诱导培养，分别于诱导后0、1、2、3、4、5h取菌。菌液经12000r/min离心1min弃上清，沉淀用50μLpH7.3的PBS重悬后,加入等体积的上样缓冲液，煮沸变性5min后，12000r/min离心1min，静置2min，取上清，进行SDS-PAGE电泳。1.9重组蛋白的Western-blot将重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后转印到硝酸纤维膜（NC膜）上，再转移至BSA封闭液中，4℃过夜；利用鼠源抗PPV高免血清、鼠抗PCV2血清(一抗)和HRP标记标记羊抗小鼠抗体(二抗)先后分别杂交,最后通过DNB显色液显色,待条带清晰后迅速用蒸馏水终止显色反应，鉴定表达的重组蛋白。2结果2.1VP2基因与多肽P21基因的PCR扩增用DNA提取试剂盒提取VP2基因的DNA，以YVP2/ZVP2为引物，进行PCR扩增，于1﹪琼脂糖凝胶中电泳观察结果，在约1740bp处出现一条特异的DNA带，与预期扩增的VP2基因大小相符（见图2）。图1PCR基因的扩增1:P21基因的PCR产物2:VP2基因的PCR产物M:Trans2KplusDNAMarker;Fig.1AmplificationofP21genebyPCRFig.2AmplificationofVP2genebyPCRM:Trans2KplusDNAMarker;12Mbp——5000——3000——2000——1000——750——500——250——10060———1740————2.4重组体pET