5-氨基乙酰丙酸对中华稻蝗(Oxyachinensis)的杀虫活性及对3种酶活性的影响

中国农业科学2008,41(7):2003-2007ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2008.07.017收稿日期：2007-07-11；接受日期：2007-09-17基金项目：国家自然科学基金项目（30570247），山西省留学基金项目，山西省自然科学基金项目（2006011075）和山西省青年基金项目（2007021030）作者简介：阴琨（1982-），女，河北乐亭人，硕士，研究方向为昆虫农药毒理学。Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]。通信作者张建珍（1971-），山西五台人，副教授，研究方向为分子毒理学。Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]5-氨基乙酰丙酸对中华稻蝗（Oxyachinensis）的杀虫活性及对3种酶活性的影响阴琨，马恩波，薛春荣，吴海花，郭亚平，张建珍（山西大学生命科学与技术学院，太原030006）摘要：【目的】研究5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinicacid，ALA）对中华稻蝗（Oxyachinensis）的杀虫活性及对3种酶活性的影响。【方法】以中华稻蝗4龄若虫为试验材料，用不同剂量的ALA（A1：250mmol·L-1；A2：450mmol·L-1；A3：750mmol·L-1；A4：1000mmol·L-1）处理中华稻蝗，观察其对中华稻蝗的毒性效应和对其体内乙酰胆碱酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性的影响。【结果】不同剂量ALA处理组中华稻蝗死亡率依处理剂量呈现上升趋势，高浓度处理组A3、A4的死亡率分别达到66.19%和80.21%；LD50值为3.61（3.29～3.93）mg·g-1虫重（95%置信范围）。生化研究结果显示，最高浓度A4处理组雌、雄虫体内AChE活性分别较对照组下降了51.53%和42.65%，差异显著（P＜0.05）；GPx活性分别较对照组下降了42.82%和43.85%，差异显著（P＜0.05）。同时，中华稻蝗GSTs活性随ALA处理剂量升高而增高，A4处理组雌、雄虫体内GSTs活性分别较对照组升高了171.05%及97.42%，差异显著（P＜0.05）。【结论】ALA对雌、雄中华稻蝗均有明显的毒性效应；ALA可引起AChE和GPx光失活，从而导致中华稻蝗神经传导受阻同时抵御氧化损伤的能力下降；高剂量ALA激活GSTs，可引发昆虫对光毒性物质的自身反馈抵御反应。关键词：中华稻蝗；5-氨基乙酰丙酸；乙酰胆碱酯酶；谷胱甘肽S-转移酶；谷胱甘肽过氧化物酶InsecticidalActivitiesof5-AminolevulinicAcidonOxyachinensisandEffectonThreeKindsofEnzymesYINKun,MAEn-bo,XUEChun-rong,WUHai-hua,GUOYa-ping,ZHANGJian-zhen(SchoolofLifeSciencesandTechnology,ShanxiUniversity,Taiyuan030006)Abstract:【Objective】Insecticidalactivitiesof5-aminolevulinicacid(ALA)onOxyachinensisandtheeffectonactivitiesofthreeenzymeswerestudied.【Method】Fourth-instarnymphsofO.chinensisweretreatedwithdifferentdosesofALA(A1:250mmol·L-1;A2:450mmol·L-1;A3:750mmol·L-1;A4:1000mmol·L-1).Motalityandtheactivitiesofacetylcholinesterase(AChE),glutathioneS-transferase(GSTs)andglutathioneperoxidase(GPx)weredeterminated.【Result】ThemortalityofO.chinensisincreasedwithincreasingdoseofALA.Themortalityofhigh-dosetreatmentsA3andA4reached66.19%and80.21%,respectively.ThevalueofLD50was3.61(3.29-3.93)mg·g-1bodyweight(95%confidenceinterval).BiochemicalstudiesshowedthattheactivitiesofAChEandGPxinA4treatmentdeclinedby51.53%and42.82%infemaleand42.65%and43.85%inmalecomparedtocontrol,respectively,andthedegreeofdeclinereachedsignificantlevelatP＜0.05.Meanwhile,GSTsactivitiesofO.chinensisenhancedwithincreasingdoseofALA,theGSTsactivitiesoffemaleandmaleO.chinensisinA4treatmentremarkablyincreasedby171.05%and97.42%comparedtocontrol(P＜0.05).【Conclusion】ALAhadobviouslytoxiceffectonO.chinensis.Moreover,ALAcausedthephotoinactivationofAChEandGPx,whichinducednervetransmissionblockingandthecapabilitiestodefendoxidationdamagedeclining.Meanwhile,high-doseALAcouldactivateGSTs,whichcausedafeedbackinhibitionofinsecttothephototoxicsubstance.Keywords:Oxyachinensis;5-Aminolevulinicacid(ALA);Acetylcholinesterase(AChE);GlutathioneS-transferase(GSTs);Glutathioneperoxidase(GPx)2004中国农业科学41卷0引言【研究意义】中华稻蝗（OxyachinensisThunberg）主要分布在非洲、大洋州和亚洲，在中国除西藏和青海等少数省份外其余各省均有分布[1]。中华稻蝗对水稻及其它禾本科植物为害严重，目前人们使用有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类等多种杀虫剂进行防治。虽然这些传统杀虫剂防治蝗虫效果显著，但有报道表明部分中华稻蝗种群对有机磷农药产生了一定程度的耐受性[2,3]。光敏剂是一种通过自身的光敏性诱发生物体氧化损伤的化合物。卟啉杀虫剂是其中毒杀效果最强的一种，其作用机理是通过产生具高氧化活性的1O2诱发机体氧化损伤从而使细胞明显失活、钝化，最终导致生物体死亡。与传统的有机磷农药相比，卟啉杀虫剂显示出以下优点：在可见光下迅速降解，降解产物无毒；其产生的活性氧在细胞上的生化作用位点较多，多数昆虫不易对其产生抗性[4]。因此，光敏杀虫剂具有成为以绿色安全方式控制蝗虫种群数量的新型环保杀虫剂的开发潜力。【前人研究进展】Rebeiz等[5]首次提出了卟啉杀虫剂（porphyricinsecticides）这一概念，并报导了卟啉杀虫剂5-氨基乙酰丙酸（ALA）对粉纹夜蛾（TrichoplusianiHubner）幼虫的毒杀作用。BenAmor等[6]研究报导了卟啉对CeratitiscapitataWiedemann、Stomoxiscalcitrans和BactroceraoleaeGmelin的毒性影响。【本研究切入点】目前对ALA及其它卟啉物质作为杀虫剂的研究，大部分集中于鳞翅目和双翅目等类群，对直翅目昆虫的毒杀作用和生化水平的影响还未见相关研究报道。【拟解决的关键问题】本文以农业害虫中华稻蝗为研究对象，探讨卟啉杀虫剂ALA的杀虫活性及对试虫体内与ALA光毒性（phototoxicity）密切相关的3种酶（乙酰胆碱酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx））的活性影响。确定ALA对中华稻蝗的杀虫活性和对神经传导、抗氧化及代谢解毒系统部分酶活性的影响，为进一步深入研究ALA的光毒性机理、蝗虫的农业防治和开发新型绿色环保型杀虫剂提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1供试昆虫中华稻蝗4龄若虫（采自山西太原市晋源区），室温下在小型纱笼中用野外采集的新鲜稗草喂养。1.1.2主要试剂5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinicacid，ALA）、乙酰硫代胆碱（acetylthiocholineiodide，ATC）、5,5'-二硫代双-（2-硝基苯甲酸）（5，5´-dithio-bis）-（2-nitrobenzoicacid），DTNB）和双金鸡纳酸（bicinchoninicacidsolution，BCA）购于美国Sigma化学试剂公司。1-氯-2,4-二硝基苯（1-chloro-2,4-dinitrobenzene，CDNB）和还原型谷胱甘肽（reducedglutathione，GSH）购于上海生工生物工程技术有限公司。谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒购于南京建成生物工程研究所。1.2试验方法1.2.1试虫处理用三蒸水溶解ALA配成如下浓度（A1组：250mmol·L-1；A2组：450mmol·L-1；A3组：750mmol·L-1；A4组：1000mmol·L-1），用20μl微量进样器吸取4μl注射于试虫腹部第二腹节侧面，对照组注射同样剂量的蒸馏水。每30头蝗虫为一个处理，雌、雄虫各15头，每个浓度设3个重复。试虫饲养在30cm×15cm×15cm的玻璃缸内，喂食新鲜的稗草。用药后试虫先经14h的黑暗饲养，然后用两盏60W（光照强度2000lx）的白炽灯在玻璃缸两侧相对进行照射，照射4h后停止光照。此过程中记录死亡虫数，48h后收集存活蝗虫并冻存于－20℃冰箱中，用于后续酶活性的测定。1.2.2酶液制备及酶活性测定1.2.2.1乙酰胆碱酯酶酶液的制备及酶活性测定参照Wu等[3]的方法，取－20℃冻存的蝗虫（每个浓度取6～8头，雌、雄虫各半，共3个重复），置于冰盒上的干净培养皿中，用解剖刀切取头部，加入0.1mol·L-1pH7.5含0.3%TritonX-100经冰水冷浴的磷酸缓冲液（组织﹕缓冲液=1g﹕10ml）；用玻璃电动匀浆机（DY892Ⅱ，宁波新芝生物科技股份有限公司）690r/min匀浆1.5min；匀浆液于4℃，15000g离心30min；将上清液转移到一个新的1.5ml离心管中，将离心管置于碎冰中，作为酶源备用。乙酰胆碱酯酶活性的测定参照Ellman[7]和杨美玲等[8]的方法。取20μl酶液置于酶标板孔中，用缓冲液作对照，取180μlATC-DTNB混合液（9.56ml的0.1mol·L-1、pH7.5磷酸缓冲液、74μl的37.5mmol·L-1ATC溶液及370μl的12mmol·L-1DTNB溶液混合）加入含酶液的酶标板孔中，立即在酶标仪上405nm处读数，每个样品测定3次，记录原始数据。1.2.2.2谷胱甘肽S-转移酶酶液的制备及酶活性测定取－20℃冻存的蝗虫，置于冰冻的干净培养皿中，7期阴琨等：5-氨基乙酰丙酸对中华稻蝗（Oxyachinensis）的杀虫活性及对3种酶活性的影响2005用解剖刀切取胸部，其后匀浆、离心等方法同1.2.2.1。谷胱甘肽S-