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高二生物学案班级：姓名：使用日期：2015年4月12日1课题3血红蛋白的提取和分离【学习要求】1.熟记凝胶色谱法、电泳法分离生物大分子的基本原理，2.了解缓冲液的组成及其作用；3.掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法。【学习过程】一、基础知识【活动1】阅读教材P64第1自然段和“凝胶色谱法”部分，讨论并回答下列问题：提取和分离蛋白质的原理：蛋白质的各种特性的差异：如分子的、所带的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的等，由此提取和分离各种蛋白质。（一）凝胶色谱法1.凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。2.原理：相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。3.具体过程：A．的蛋白质由于作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。B．（1）蛋白质混合物；（2）开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；（3）相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质移动。（4）不同的蛋白质分子完全分开；（5）的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，的蛋白质还在行进中。（二）缓冲溶液【活动2】阅读教材P65“缓冲溶液”部分，讨论并回答下列问题：1．缓冲溶液的作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制对溶液pH的影响，而保持。2．缓冲溶液通常由1～2种溶解于水配制而成。调节可以制成在不同pH范围内使用的缓冲液。【思考1】维持人体血液pH稳态的缓冲对有。（三）电泳【活动3】阅读教材P65-66“电泳”部分，讨论并回答下列问题：1.概念：电泳是指在的作用下发生的过程。2.原理：许多重要的生物大分子，如等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其移动。3.在电泳过程中，决定带电分子迁移方向的是带电分子，决定带电分子迁移快慢的是带电分子、电量的不同。4.常用的电泳方法是和，在测定蛋白质分子量时通常使用。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于以及等因素。为了消除样品分子原有净电量对迁移速率的影响，可以在凝胶中加入，使样品分子的迁移速率完全取决于。二、实验操作【活动4】阅读教材P66最后自然段和P67“样品处理”部分，讨论并回答下列问题：蛋白质的提取和分离的一般分为四步：、、和。（一）样品处理及粗分离1.红细胞的洗涤洗涤的目的是去除，以利于后续步骤的分离纯化。为防止血液凝固，应预先加入；所用洗涤液是倍于红细胞液的；洗涤中用玻璃棒，用离心机离心；洗涤干净的标准是。2.血红蛋白的释放：在和作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。3.分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试凝胶颗粒相对分子质量较小的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质（1）（2）（3）（4）（5）BA多孔板高二生物学案班级：姓名：使用日期：2015年4月12日2管中的溶液分为4层:第1层（最上层）：甲苯层第2层（中上层）：的沉淀层，色薄层固体第3层（中下层）：的水溶液层，的液体第4层（最下层）：其它杂质的沉淀层将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透明液体，即溶液。4.透析将血红蛋白溶液装入中，放入中透析12h。透析的目的是除去血红蛋白溶液中的无机盐离子和有机小分子物质。（二）凝胶色谱操作【活动5】阅读教材P67-68“凝胶色谱操作”部分，讨论并回答下列问题：1.第一步要制作，第二步要，因为，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有存在。第三步是。2.（1）凝胶的选择：。（2）方法：配制凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于中充分溶胀后，配成。（3）凝胶色谱柱的装填方法①固定：将色谱柱垂直固定在支架上②装填：将一次性的缓慢倒入内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。③洗涤平衡装填完毕后，用充分洗涤平衡12h，使凝胶装填。3.样品加入与洗脱（1）加样前：打开下端流出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐，关闭出口。（2）加透析样品：用吸管沿将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏。（3）洗脱和收集：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱，待接近色谱柱时，用试管收集流出液，（三）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳判断的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度三、操作提示【活动6】阅读教材P69“操作提示”部分，讨论并回答下列问题：1．红细胞的洗涤时，洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高或离心时间过长，会使等一同沉淀。2．为了加快凝胶膨胀，可以将加入的湿凝胶用加热，不仅节约时间，还能除去凝胶中的和。3．凝胶色谱柱中不能存在气泡，原因是气泡会，降低分离效果。思考2：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。【当堂检测】1.请将下列实验流程图补充完整：2.凝胶色谱法和凝胶电泳法是分离蛋白质的两种常用方法，据此回答问题。①凝胶色谱法分离蛋白质的原理是根据不同大小的蛋白质分子在凝胶柱中的不同而实现分离的：②使用电泳法分离蛋白质．是利用了待分离样品中各种分子的差异，以及分子本身的、形状的不同。