8细菌与病毒的微生物学检查法

DepartmentofMicrobiology,HarbinMedicalUniversityDepartmentofMicrobiology,HarbinMedicalUniversityMedicalMicrobiologyMedicalMicrobiology医医学学微微生生物物学学DepartmentofMicrobiology,HMUDepartmentofMicrobiology,HMU哈尔滨医科大学哈尔滨医科大学微生物学教研室微生物学教研室第七章细菌与病毒的微生物学检查法微生物学教研室[e-mail]教学大纲掌握内容标本的采集和送检原则病原菌的检验程序细菌感染的血清学诊断及常用方法了解内容病原体的抗原成分、核酸及其他成分的检测方法病原学检查的目的进行病因学诊断指导合理用药观察治疗进行传染病的流行病学调查标本的采集和送检六原则※无菌操作：避免杂菌污染不同期不同标本用抗生素以前采集病变明显部位运送注意保存采集双份血清第一节细菌感染的微生物学检查法可疑细菌感染采集标本血清学实验双份血清直接形态学检查细菌成分检测特异性抗体检测细菌分离培养鉴定形态学检查生化学检查血清学鉴定药物敏感实验动物（毒力）实验抗原检测核酸检测直接凝集实验协同凝集实验乳胶凝集实验免疫荧光检测ELISA等核酸杂交聚合酶链反应（PCR）DNA芯片凝集反应沉淀反应补体结合试验中和试验ELISA等细菌学诊断检测病原菌成分检测患者血清中特异性抗体细菌病原学检查法形态学检查分离培养,纯培养生化试验血清学鉴定药物敏感试验毒力实验动物实验抗原核酸一、细菌学诊断（一）形态学检查1.光学显微镜检查法：细菌染色检查法革兰染色法抗酸染色法负染法2.暗视野检查：用于检查活菌、螺旋体及其动力3.荧光显微镜脑脊液的直接涂片染色-肺炎链球菌链球菌淋病奈瑟球菌-脓液直接涂片结核分枝杆菌霍乱弧菌暗视野显微镜钩端螺旋体肺炎双球菌病原菌的分离培养/直接涂片大小形态颜色表面性状透明度溶血性Flamesterilizewireloop,metalforceps,etcbeforeandafteruseinahoodedBunsenburner细菌动力的检测化脓性球菌葡萄球菌链球菌肠道杆菌大肠埃希菌沙门氏菌志贺菌细菌形态无特异性可采用生化学检查法-鉴别细菌的重要方法（二）生化试验糖发酵试验H2S试验枸橼盐利用试验鉴定中最重要的生化反应※乳糖发酵试验肠道非致病菌（埃希菌属）发酵乳糖、产酸产气＋肠道致病菌（志贺菌属、沙门菌属等）不发酵乳糖—（三）血清学鉴定利用含已知的特异性抗体的免疫血清，检测未知的细菌抗原，对细菌进行种的鉴定志贺菌属、沙门菌属常用方法是玻片凝集试验测定抗生素或其他抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力方法：扩散法、稀释法（四）药物敏感试验MIC&MBC最低抑菌浓度，MIC最低杀菌浓度，MBC全自动分析仪全自动细菌鉴定仪全自动生化分析仪（五）检测毒力-动物实验1.常用动物MouseGuineaPigRabbitDogMonkey接种途径皮内皮下腹膜内静脉颅内椎管内鼻内灌胃毒力检测半数致死量LD50半数感染量ID50二、检测病原菌成分抗原的检测核酸的检测（一）抗原的检测利用已知的特异性Ab检测Ag的方法常用的方法有玻片凝集协同凝集试验ELISA免疫荧光法ELISA（二）核酸检测方法聚合酶链反应（PCR）核酸杂交技术SouthernblotNorthernblotDotblotInsituhybridization基因芯片(Genechip)16SrRNA16sRNA基因序列分析只存在于原核细胞型微生物的染色体基因中16sRNA，23sRNA,5sRNA可变区和保守区保守区：所有的细菌所共有可变区：属和种的特异性PCRGeneChip三、抗体的检测用已知细菌或其Ag检测相应的特异性Ab及其量的多少，作为某些病原菌感染的辅助诊断急性期和恢复期双份血清，恢复期效价升高≥4倍有诊断价值方法玻片或试管凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、冷凝集试验、ELISA局限难以早期诊断第二节病毒感染的微生物学检查法形态学病毒的分离鉴定在培养细胞中增殖的鉴定指标病毒成分的检测病毒抗体的检测（一）病毒的形态学检查电子显微镜（EM）免疫电镜,IEM光学显微镜（CM）包涵体内基小体（Negribody）HAVNegribody动物接种：动物模型鸡胚接种：9～14d组织培养器官培养组织培养细胞培养原代细胞培养二倍体细胞培养传代细胞培养三大培养方法（二）病毒的分离培养的方法血凝抑制实验中和实验PCR检测病毒分离培养及鉴细胞病变（cytopathy)※红细胞吸附(hemadsorption)病毒干扰作用(viralinterference)中和试验(neutralizationtest,NT)空斑形成试验(plaqueformation)病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标※细胞病变—细胞病变效应※（CPE）细胞病变效应（CPE）A：未感染病毒的HeLa细胞；B：被柯萨奇病毒B3感染后，细胞变圆、皱缩，细胞折光性减弱；C：被腺病毒感染后，细胞肿胀，折光性增强，呈葡萄状排列。20050%组织细胞感染量TCID50:根据有无细胞病变来判断病毒感染性和毒力的指标细胞病变红细胞吸附：血凝素（HA）病毒干扰作用中和试验病毒数量及感染性的检测空斑形成试验红细胞凝集红细胞吸附病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标plaque空斑形成试验用于病毒浓度的精确定量和测定抗病毒药物的作用一个空斑是由一个病毒大量复制而成，称为空斑形成单位（Plaqueformingunit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示（三）病毒成分的检测病毒抗原的检测:ELISA病毒核酸的检测核酸杂交、PCR、基因芯片病毒成分的检测（四）病毒抗体的检测中和试验（NT）血凝抑制试验（HT）补体结合试验（CF）ELISA法蛋白印迹技术小结细菌感染的微生物学检查法病原体检查核酸的检测抗原、抗体的检测病毒感染的微生物学检查法电镜及免疫电镜病毒的分离培养和鉴定核酸的检测抗原、抗体的检测小结抗细菌免疫固有免疫※获得性免疫抗病毒免疫固有免疫干扰素※获得性免疫问题采集标本的原则？病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标？干扰素的概念及其抗病毒机制自检内容1.机体抗结核分枝杆菌的感染免疫主要依赖A.屏障结构B.细胞免疫C.抗体的中和作用D.非特异性免疫分子E.吞噬细胞的吞噬作用2.灭活和清除游离病毒主要依靠A.干扰素B.抗体C.细胞因子D.非特异性免疫分子E.皮肤粘膜屏障自检内容3.抑制病毒的增殖，保护邻近细胞免疫受病毒感染的抗病毒作用机制是A.抗体B.NK细胞C.细胞因子D.干扰素E.CRP4.伤寒病人，病程有5天左右，应采集的标本是A.血液B.粪便C.尿液D.咽部E.脓液