6.4氧的供需及对发酵的影响

7.4氧的供需及对发酵的影响溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。在28℃氧在发酵液中的100％饱和浓度只有0.25mmol.L-1左右，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100％空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几分钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。7.4.1微生物对氧的需求一、描述微生物需氧的物理量比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气，mmolO2·g菌-1·h-1摄氧率(OUR，r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1X:菌体密度,g菌/LXQOUR2O二、溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响cCrQO2cLcCr:临界溶氧浓度,指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度,一般用空气氧饱和度表示。一般对于微生物：CCr:＝1～15%饱和浓度例：酵母4.6*10-3mmol.L-1,1.8%产黄青霉2.2*10-2mmol.L-1,8.8%定义：临界溶氧浓度＝临界时发酵液中氧的浓度/氧饱和度所以对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧浓度不低于临界氧浓度即可微生物温度临界氧值/(mmolO2/L)温度/C临界氧值/(mgO2/L)大肠杆菌37.60.00820.003115.00.26酵母34.80.00460.003720.00.60产黄青霉30.00.00900.022024.00.40问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中氧很容易满足例：以微生物的摄氧率0.052mmolO2·L-1·S-1计，0.25/0.052=4.8秒(0.25为溶解氧浓度)注意：由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样：头孢菌素卷须霉素生长阶段5-7%(相对于饱和浓度）13-23%产物合成10-20%8%在菌体生长和产物合成阶段,并非溶解氧浓度越高越好卷须霉素发酵时,在40-140h维持氧在10%比在0或45%时的产量都要高过高的溶氧对菌体生长有害,主要原因可能是新生O,超氧化物基和过氧化物基,或羟基自由基对菌体组分的破坏2O22OOH三、影响需氧的因素菌体浓度QO2遗传因素菌龄营养的成分与浓度有害物质的积累培养条件XQOUR2O7.4.2反应器中氧的传递一、发酵液中氧的传递方程(氧的溶解情况)CLCiPPi气膜液膜N：单位接触面积传氧速率kmol/m2.hkg:气膜传质系数;kmol/m2.h.atmKL:液膜传质系数m/h气液界面:氧从气膜到液膜LiLigcckPPkNC*:与气相中氧分压相平衡的液体中氧的浓度KL:以氧浓度为推动力的总传递系数(m/h)c*:氧在水中的饱和浓度mmol/L所有能增加以上两指标的因素都能改善供氧再令：单位体积的液体中所具有的氧传递面积为a(m2/m3)Nv：体积传氧速率kmol/m3.hKLa:以(c*-c)为推动力的体积溶氧系数h-1LLVccaKNLLcckN二、发酵液中氧的平衡发酵液中供氧和需氧始终处于一个动态的平衡中)c*c(aKN:LLV传递消耗：OUR=QO2.X氧的平衡最终反映在发酵液中氧的浓度上面三、供氧的调节cL有一定的工艺要求，所以可以通过KLa和c*来调节其中c*＝P/HP:氧分压H:亨利常数,与温度及液体中固形物质的浓度有关NvHPKLa)c*c(aKNLLV调节KLa是最常用的方法，KLa反映了设备的供氧能力，一般来讲大罐比小罐要好。45升1吨10吨搅拌速度250rpm120120供氧速率7.610.720.17.4.3影响KLa的因素KLa反映了设备的供氧能力，发酵常用的设备为摇瓶与发酵罐。一、影响摇瓶KLa的因素为装液量和摇瓶机的种类摇瓶机往复，频率80-120分/次，振幅8cm旋转，偏心距25、12,转速250rpm装液量，一般取1/10左右：250ml15-25ml500ml30ml750ml80ml例：500ml摇瓶中生产蛋白酶，考察装液量对酶活的影响装液量30ml60ml90ml120ml酶活力713734253921、理论上分析KLan：转速d：搅拌桨直径通气量A.提高搅拌，调节KLa的效果显著二、影响发酵罐中KLa的因素提高搅拌增强溶氧系数的原因搅拌能把大气泡打成微小气泡,增加了接触面积,延长了接触时间(小气泡上升慢)搅拌使液体作涡流运动,延长了气体在罐体内上升的时间搅拌使液体呈湍流运动,减少了气泡周围液膜的厚度搅拌使菌体分散,增加了接触面积,有利于氧的传递过度剧烈搅拌产生的剪切力很大,要考虑到对细胞尤其是菌丝体的损伤B.搅拌器类型:轴向式(桨式,锚式,框式,推进式)和径向式(涡轮式)圆盘涡轮式的溶氧效果最好,主要产生径向液流,但不利于罐内液体的混合因此,下组用圆盘涡轮式搅拌打碎气泡,上组用平浆式搅拌混合料液叶径d:相对位置:下组搅拌器离罐底0.8-1d较好,两组搅拌器之间的距离也要仔细考虑搅拌器的组数:C.空气线流速SLVaK)72.04.0(:);s/m(:VS间约指数空气线流速空气线速度过大时,会发生”过载”现象,即浆叶不能打散空气,气流形成大气泡在浆的周围逸出例某一产品的发酵dnc产量45018020%497845028040%556455018060%8455例黑曲霉生产糖化酶n230230270通气比1:0.81:1.21:0.8产量181224162846提高d、n显著提高c,提高了产量提高N,比提高Q有效D.空气分布器E.液体的粘度空气分布器的类型,喷口直径,管口与罐底距离影响气泡的大小,稳定性和氧的传递效率F.氧分压增大罐压或增大通入气体中的氧分压(如通入纯氧)G.发酵罐内液柱高度经验:H/D从1增加到2,KLa可增加40%;从2增加到3,KLa增加20%.一般以2-3为宜H.发酵罐体积大罐氧利用率高相同几何形状的罐体,体积大的氧利用率可达7-10%;而体积小的只有3-5%2、实际上：对于转速的调节有时是有限度的通风的增加也是有限的蒸发量大中间挥发性代谢产物带走例：红曲霉生产色素用于食品工业，静止培养改为通气培养，比色法测定产量：通气0(静止)1.42.03.16.819.5OD0.280.78.315.614.36.2提高下降所以这些因素的存在，发酵设备的供氧是有限的3、小型发酵罐和大型发酵罐调节KLa的特点小型发酵罐，转速可调大型发酵罐，转速往往不可调大型反应器的合理设计对现有设备一定要注意工艺配套7.5.4CL、OUR和KLa的测定一、CL的测定1、碘量法2、溶氧电极极谱型(阴极)：O2+2H++2e→H2O2原电池型(阴极)：O2+2H2O+4e→4OH-测定：一般是得到相对值二、OUR的测定1、物料衡算流量（进口空气中氧的氧含量—出口空气中的氧含量）OUR=————————————————————————发酵液体积氧的浓度：氧分压仪停止供气：dCL——=-OURdt–用溶氧电极测定OUR，要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的变化–测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代表的溶氧浓度：残饱－iiC*i饱——在饱和氧浓度C*时的电流值i残——氧浓度为零时电极所具有的电流2、溶氧电极–若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。此时，由于耗氧，CL下降，仪表上电流值也不断下降)ti(iiCOUR*残饱－△t——停止供气后CL下降到最低点时所需时间△i——在△t时间内的电流变化三、KLa的测定1、亚硫酸盐法（冷膜）氧→亚硫酸钠的氧化KLa.C*=亚硫酸浓度的降低Cu2+2Na2SO3+O2→2Na2SO42、平衡法OURKLa=————C*-CL例：一个装料为7L的实验室小罐，通气量为1VVM（标态），发酵液的CL＝25%、空气进入时的氧含量为21%，废气排出的氧含量为19.8%，求此时菌体的摄氧率和发酵罐的KLa式中C*可以查得，CL可以用溶氧电极测得，OUR也可算出，因此可求得KLa值待溶氧到最低点后再恢复通气。这样可以得到溶氧随时间变化的曲线用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时供氧和需氧达到平衡，溶氧是一条水平线这时停止通气，保持搅拌，在罐顶通入氮气，赶掉氧气。由于微生物对氧的利用，溶氧迅速下降，过一段时间溶氧下降缓慢3、动态法△CL/△t=KLa(C*-CL)-OURCL=-1/KLa(△CL/△t+OUR)+C*将CL对△CL/△t+OUR作图，得到一条直线，斜率为-1/KLa因此可求得KLa，延长直线与纵坐标相交点为C*溶解氧浓度随通气变化的情况KLa的求取OUROUR7.4.5溶氧浓度的变化及其控制一、典型的分批发酵中氧浓度的变化规律（一定KLa下）：OURXQCL一般有一个低谷，在对数生长的末期二、发酵过程中溶氧的控制1、溶氧控制的策略微生物反应:XS→P+Xπ=a+bμX,PtPX0t10～t1∶growthphaset1～end∶producingphase菌体生长期：酶系统Ⅰ酶系统Ⅱ关键因子开始的细胞长好以后的细胞产物形成期：底物产物酶系统Ⅱ反应动力学问题发酵过程的控制一般策略：前期有利于菌体生长，中后期有利用产物的合成溶氧控制的一般策略：前期大于临溶氧浓度，中后期满足产物的形成。2、溶氧控制的实例GAXDO谷氨酸发酵：要求：氧饱和度1控制：0-12小时小通风12小时后增加通风原因：0-12小时菌体量较小，采用小通风12一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。例：生产肌苷酸：通气量不变17.15mg/ml24小时增加22.55mg/ml30小时增加18.25mg/ml36小时增加12.34mg/ml例:溶氧在青霉素发酵控制中的应用控制的原则:加糖速率正好使培养处于半饥饿状态,即仅能维持菌的正常生理代谢,而把更多的糖用于产物的合成.三、发酵过程中溶氧浓度监控的意义1、考察工艺控制是否满足要求2、其它异常情况的表征染菌、噬菌体、设备和操作故障3、间接控制的措施染菌后可能出现异常”跌零”;也可能出现溶氧升高搅拌停止,溶氧降低;加油过量,溶氧降低;作为质量控制的指标:如天冬氨酸发酵,酵母发酵中好气转为厌气培养的时机是关键小节：了解微生物对氧的需求并掌握其中的基本概念掌握反应器氧的传递方程，及其参数的测定深入理解KLa的意义，了解反应器放大的基本概念掌握发酵过程中溶氧浓度的调节方法，并认识监控溶氧浓度的意义