6叶绿体的分离与荧光观察

实验七叶绿体的分离与荧光观察【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的原理和方法。2、掌握荧光显微镜的原理及使用方法。【实验原理】细胞或组织经过破碎后制成匀浆，在等渗介质中进行差速离心，利用细胞各组分质量大小、形状和密度的不同，选择不同的离心力和离心时间，即可分离得到所需要的细胞器或大分子组分。分离叶绿体在等渗的缓冲溶液中进行,最好在0～4℃温度下进行,要迅速分离和观察。荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。荧光是某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，若停止供能荧光现象立即停止。直接荧光:如叶绿素的火红色荧光间接荧光:如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光【实验用品】1、器材：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。研钵、烧杯,10ml刻度离心管，滴管，纱布，载片和盖玻片等。2、材料：新鲜菠菜。3、试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridineorange)。【实验方法】（一）叶绿体的分离1、选用生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片洗净后去除中脉，然后放入0～4℃冰箱或冰瓶中预冷。2、取叶片经滤纸吸干水后，称取3g剪成碎片，于45mL0.35mol/L氯化钠溶液中，置于研钵中，用手工快速研磨，(注意不要用力过猛，也不必研磨过细)。3、研磨后将匀浆用6层新纱布过滤，滤液盛于烧杯中。4、将5mL滤液装入预冷过的离心管，经天平平衡后，以1000rpm，4℃离心2min，弃去沉淀。5、上清液再经3000rpm，4℃离心5min，倾去上清液，沉淀即为叶绿体。6、沉淀用2mL0.35mol/L氯化钠溶液悬浮，放入冰箱中备用。（二）叶绿体的观察1、用滴管吸取少量叶绿体悬浮液于载玻片上，加盖玻片后，吸水纸吸去玻片周围多余的溶液，分别置普通光学显微镜和荧光显微镜下镜检观察。2、用滴管吸取1滴叶绿体悬浮液于载玻片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙染液，盖好盖玻片后，吸水纸吸去玻片周围多余的溶液，在荧光显微镜下观察.【实验报告】1、绘制普通光学显微镜下观察的叶绿体的形态示意图。2、记录荧光显微镜观察的现象，分析结果。【思考题】1、分离叶绿体操作过程中应注意什么？2、普通光学显微镜和荧光显微镜的原理及结构有何异同点？