条斑紫菜SAMS基因克隆与生物信息学分析

书书书中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（７）：４３～４９条斑紫菜ＳＡＭＳ基因克隆与生物信息学分析易乐飞１　王　萍１　周向红１　刘楚吾２（１淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室　连云港　２２２００５　２广东海洋大学水产学院　湛江　５２４０８８）摘要　干旱、高盐和低温是限制植物生长和农作物产量的主要逆境因子。Ｓ?腺苷甲硫氨酸合成酶（Ｓ?ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＳＡＭＳ）与植物抗逆境密切相关，而且超表达ＳＡＭＳ的转基因植物具有更高的抗干旱、高盐和低温能力。进行条斑紫菜（Ｐｏｒｐｈｙｒａｙｅｚｏｅｎｓｉｓ）Ｓ?腺苷甲硫氨酸合成酶基因（ＰｙＳＡＭＳ）ｃＤＮＡ的克隆及序列特征分析。首先利用电子克隆技术得到基因相关的ｃｏｎｔｉｇ，预测全长并设计引物，最后利用ＲＴ?ＰＣＲ技术成功克隆了ＰｙＳＡＭＳ的ｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＦＪ４０４７４８）。该ｃＤＮＡ序列含有长１１５５ｎｔ的完整ＯＲＦ，编码蛋白（ＰｙＳＡＭＳ）分子量４１．８ｋＤａ，长３８４ＡＡ。ＰｙＳＡＭＳ与盘基网柄菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、莱茵衣藻（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）和水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）等多种生物的ＳＡＭＳ具有较高的序列一致性，含有与ＳＡＭＳ酶活性密切相关的氨基酸残基和保守序列，与人（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）和大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）的ＳＡＭＳ具有高度相似的三维结构。所以ＰｙＳＡＭＳ与其它生物的ＳＡＭＳ一样，在条斑紫菜的抗逆过程中发挥重要作用。研究ＰｙＳＡＭＳ有助于阐明条斑紫菜耐受非生物胁迫的作用机理，有助于获得高抗逆转基因植物。关键词　条斑紫菜　Ｓ?腺苷甲硫氨酸合成酶　克隆　生物信息学中图分类号　Ｑ７８收稿日期：２００８１１２４　　修回日期：２００８１２１０国家科技支撑计划（２００７ＢＡＤ２９Ｂ０３）、江苏省海洋生物技术重点实验室开放课题（２００８ＨＳ００４）资助项目通讯作者，电子信箱：[e-mail]　　干旱、高盐和低温是限制植物生长和农作物产量的主要逆境因子，克服干旱、高盐和低温对农业生产的制约，培育具有良好抗逆特性的作物品种，一直是各国科学家关注的焦点［１］。随着分子遗传育种的发展，利用抗逆基因对作物进行基因工程改良已成为作物育种的重要途径并且成效显著［２］。分离抗逆基因是基因工程改良的第一步。条斑紫菜（Ｐｏｒｐｈｙｒａｙｅｚｏｅｎｓｉｓ）经过长期进化形成了适应极端环境的抗逆基因和生理生化机制。自然条件下，条斑紫菜叶状体生活在海水中；能在０．５℃的低温下正常生长，－２０℃冷藏长达数月后，下海仍能复活并正常生长；能耐受长达２至３天的缺水状态，即使被太阳晒干发脆，涨潮后仍能正常生活。因此充分挖掘条斑紫菜的抗逆基因对作物的基因工程改良意义重大。　　研究表明，Ｓ?腺苷甲硫氨酸合成酶（Ｓ?ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＳＡＭＳ，ＥＣ２．５．１．６）基因受多种非生物胁迫的诱导表达。例如甘薯（Ｉｐｏｍｏｅａｂａｔａｔｓ）ＳＡＭＳ基因受低温胁迫诱导表达［３］；大洋洲滨藜（Ａｔｒｉｐｌｅｘｎｕｍｍｕｌａｒｉａ）［４］和西红柿（ＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＭｉｌｌ．）［５，６］的ＳＡＭＳ基因受到盐胁迫诱导表达；烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）的ＳＡＭＳ２基因受氧化胁迫、盐胁迫及高温胁迫诱导表达［７］；盐地碱蓬（Ｓｕａｅｄａｓａｌｓａ）ＳＡＭＳ基因受ＮａＣｌ、ＡＢＡ及干旱胁迫的诱导表达［８］；糜子（Ｐａｎｉｃｕｍｍｉｌｉａｃｅｕｍ）ＳＡＭＳ基因的表达涉及糜子响应干旱胁迫及干旱后复水过程，可能是糜子抗旱节水的关键基因［９］。ＳＡＭＳ基因与植物对干旱、盐碱和低温的抗性密切相关，并协助植物耐受非生物胁迫。ＳＡＭＳ催化ＡＴＰ和Ｌ?甲硫氨酸合成Ｓ?腺苷甲硫氨酸（Ｓ?ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，ＳＡＭ）［１０］。ＳＡＭ是生物体内重要的中间代谢物，参与多种生化反应，在医学上ＳＡＭ被用来治疗关节炎、忧郁症和急、慢性肝炎［１１，１２］。ＳＡＭ在医药工业上应用日益广泛，需求量也日趋增大，工业上越中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．２９Ｎｏ．７２００９来越多地使用ＳＡＭＳ酶促转化法生产ＳＡＭ［１３］。　　目前已经在多种生物中克隆了ＳＡＭＳ基因，但尚无条斑紫菜ＳＡＭＳ基因（ＰｙＳＡＭＳ）的相关报道［１０］；本文以电子克隆技术为指导，用ＲＴ?ＰＣＲ方法克隆了ＰｙＳＡＭＳ的ｃＤＮＡ序列，并对其序列进行了分析。ＰｙＳＡＭＳ的克隆在理论上有助于阐明条斑紫菜抗干旱、高盐和低温等非生物胁迫的作用机制；在实践上有利于对作物进行基因工程改良，为ＳＡＭ的工业生产提供新的备选酶源。为条斑紫菜功能基因的快速克隆以及进一步开发、利用条斑紫菜资源奠定基础。１　材料与方法１．１　材料和主要试剂　　条斑紫菜叶状体取自连云港近海海域。Ｔｒｉｚｏｌｒｅａｇｅｎｔ购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭＨＭｉｎｕｓＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒和ＬａｍｂｄａＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩＭａｒｋｅｒ３购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，ＴａｑＰｌｕｓＩ（Ｔａｑ＋Ｐｆｕ）和ｄＮＴＰ购于ＢｉｏＢａｓｉｃ公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，氯仿、异丙醇、ＤＥＰＣ、乙醇等其他常规试剂均为进口或国产分析纯。１．２　条斑紫菜叶状体总ＲＮＡ抽提　　取１００ｍｇ组织，液氮研碎，加入１ｍｌＴｒｉｚｏｌ液裂解细胞，经氯仿抽提后用等体积的１∶１（Ｖ／Ｖ）的异丙醇和高盐溶液（１．２ｍｏｌ／Ｌ氯化钠＆０．８ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠）沉淀，７５％乙醇漂洗２遍后溶于无ＲＮａｓｅ水中。电泳和核酸蛋白定量仪检测ＲＮＡ的完整性、含量和纯度。－２０℃保存备用。１．３　电子克隆（ｉｎｓｉｌｉｃｏｃｌｏｎｉｎｇ）与设计引物　　以模式生物的ＳＡＭＳ的氨基酸序列作为查询序列，使用ｔＢｌａｓｔｎ检索ＧｅｎＢａｎｋ中条斑紫菜表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ，ＥＳＴ）数据库（ｄｂＥＳＴ）［１４］。将检索到的相似性高且含有ＳＡＭＳ保守序列的ＥＳＴ序列作为种子序列，接着用Ｂｌａｓｔｎ去检索条斑紫菜ｄｂＥＳＴ，将检索到的ＥＳＴ序列用ＣＡＰ３程序组装和延伸［１４，１５］。重复检索、延伸步骤直到不能延伸为止，最后得到ＰｙＳＡＭＳｃＤＮＡ的ｃｏｎｔｉｇ。在ｃｏｎｔｉｇ的基础上，针对开放阅读框（ＯＲＦ）设计下列引物：上游引物５′ＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＴ３′，下游引物５′ＡＡＴＧＣＡＡＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＡ３′。预计扩增片段长１３６７ｂｐ，包含ＰｙＳＡＭＳ的完整ＯＲＦ。１．４　ＲＴ?ＰＣＲ反应与测序　　取２μｇ总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物，用ＭＢＩ的第一链ｃＤＮＡ合成试剂盒，按说明书的反应条件合成单链ｃＤＮＡ。ＰＣＲ反应体系为２５μｌ，其中含２．５μｌ１０×ＰＣＲ反应缓冲液，１．７５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，上下游引物各０．５μｍｏｌ／Ｌ，４ＵＴａｑＰｌｕｓＩ，１μｌＲＴ产物为模板。ＰＣＲ循环为：９５℃预变性３ｍｉｎ，然后３０个循环，每个循环９５℃变性６０ｓ，４８．７℃退火３０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，最后７２℃充分延伸５ｍｉｎ，４℃保存。反应后取１μｌ电泳。将ＰＣＲ产物送上海生工进行测序。１．５　生物信息学分析　　分析测序结果，推导ＯＲＦ及编码蛋白的氨基酸序列，利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ、ＤＡＳ?ＴＭｆｉｌｔｅｒ和ＰｒｏｔＳｃａｌｅ进行编码蛋白的各种基本理化特性、跨膜结构域和疏水性分析［１６，１７］，用ＰＳＯＲＴ和ＴａｒｇｅｔＰ进行信号肽分析［１８，１９］，以编码蛋白为探针对ＧｅｎＢａｎｋ中的非冗余的蛋白质数据库进行Ｂｌａｓｔｐ分析［１４］，使用ＣｌｕｓｔａｌＷ程序进行多序列比对［２０］，ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ和ＣＤＤ进行功能结构域分析［２１，．２２］，Ｓｗｉｓｓ?ｍｏｄｅｌ和ＵＣＳＦＣｈｉｍｅｒａ进行三维结构预测和三维比对［２３，２４］，进而判断该蛋白是否为新序列以及推导蛋白功能。２　结　果２．１　ＰｙＳＡＭＳ的电子克隆　　以拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）ＳＡＭＳ序列（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿１９２０９４）作为查询序列，在条斑紫菜的ｄｂＥＳＴ中进行ｔＢｌａｓｔｎ，获得了１７条高度相似并且彼此重叠的ＥＳＴ序列（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＵ１８７７３１、ＡＵ１９６９５８、ＡＶ４３４４９８、ＡＵ１９４４２３、ＡＵ１９４１８２、ＡＵ１９１５２８、ＡＵ１９２７９２、ＡＵ１９３８９７、ＡＵ１９３９５２、ＡＶ４３２１３２、ＡＶ４３６１１６、ＡＶ４３１７７０、ＡＶ４３６３１１、ＡＵ１８７１０４、ＡＶ４３６３５１、ＡＶ４３５３６７、ＡＶ４３８０４１），最后拼接产生１条长１５７０ｂｐ的ｃｏｎｔｉｇ。２．２　ＲＴ?ＰＣＲ与测序结果　　ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳分离后呈现一条长约１３７５ｂｐ的特异性条带，与预期的１３６７ｂｐ的扩增片段十分接近（图１）。测序获得了ＰｙＳＡＭＳｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＦＪ４０４７４８）。ＰｙＳＡＭＳｃＤＮＡ序列与电子克隆得到的ｃｏｎｔｉｇ序列比对结果表明两者不同的碱基仅８个，一致性为９９．３６％。ＰｙＳＡＭＳｃＤＮＡ与ｃｏｎｔｉｇ的编码蛋白的比对结果显示两者氨基酸序列完全相同，一致性为１００％。如果将个体间多态性和ＥＳＴ固有的错误率等因素考虑进去，测序结果与电子克隆结果一致。２．３　ＰｙＳＡＭＳｃＤＮＡ序列的生物信息学分析　　ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ程序在ＰｙＳＡＭＳｃＤＮＡ序列的第２５～４４２００９，２９（７）易乐飞等：条斑紫菜ＳＡＭＳ基因克隆与生物信息学分析图１　ＰＣＲ扩增产物电泳Ｆｉｇ．１　Ｇｅ１ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＰＣＲｒｅｓｕｌｔ１：ＰＣＲｒｅｓｕｌｔ；Ｍ：λＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩＭａｒｋｅｒ１１７９ｎｔ处发现有一连续ＯＲＦ，第２５～２７ｎｔ处是该ｃＤＮＡ序列的第一个ＡＴＧ密码子，其下游的＋４位是Ｇ，上游－３位是Ａ，符合典型的ｋｏｚａｋ规则，再结合推导的氨基酸序列Ｎ端同源性比较结果，可以认定第一个ＡＴＧ是该基因的起始密码子［２５］。因此克隆得到的ｃＤＮＡ序列含有完整的ＯＲＦ，编码蛋白（ＰｙＳＡＭＳ）长３８４ＡＡ。ＰｙＳＡＭＳ分子量大小为４１．８ｋＤａ，其碱性氨基酸（Ｋ、Ｒ）、酸性氨基酸（Ｄ、Ｅ）、疏水性氨基酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）和极性氨基酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）含量分别为４４、５６、１３０和８１个，等电点为５．６。疏水性分析结果表明（图２），ＰｙＳＡＭＳ在第２０２位的Ｖａｌ亲水性最强（－２．３５６），第３１７位的Ｉｌｅ疏水性最强（１．７８９）；亲水性区域均匀分布在整个肽链中，且分值高，而疏水性区域较少，分值低，因此ＰｙＳＡＭＳ在一级结构上以亲水性为主。ＰｙＳＡＭＳ基因没有跨膜结构域，结果与疏水性分析相符合。信号肽分析表明ＰｙＳＡＭＳ不存在信号肽酶切位点，可以推断，ＰｙＳＡＭＳ在细胞质中合成后，不进行蛋白转运，而保留在细胞质基质中，直接与代谢底物相作用。图２　ＰｙＳＡＭＳ的疏水性预测结果Ｆｉｇ．２　ＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｏｆＰｙＳＡＭＳ　　以ＰｙＳＡＭＳ为探针对ＧｅｎＢａｎｋ中的非冗余蛋白质数据库进行Ｂｌａｓｔｐ分析，结果发现盘基网柄菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、莱茵衣藻（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、拟南芥和水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）等多种生物的ＳＡＭＳ与其高度相似（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ），但在条斑紫菜的蛋白质数据库没有找到与之高度相似的序列。将上述生物的ＳＡＭＳ和ＰｙＳＡＭＳ进行多序列比对（图３，仅显示部分比对结果），并用ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ?ｊｏｉｎ