6碱性磷酸酶的分离提取

实验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定目的要求：1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活测定的方法1.原理碱性磷酸酶(AlkalinephosphataseEC3.1.3.1简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作中特别注意以下几点：(1)取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量高的材料。(2)用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。(3)在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。酶活力的分析：通常是以对-硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/LMg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物pNP在405nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405nm值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为：在37℃下，以2mmol/LpNPP为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2mmol/LMg2+的测活体系中每分钟催化产生1mol/LpNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（Folin-Phenolreagent）显色法2操作方法2.1牡蛎碱性磷酸酶的分离提取(1)每组称取20g牡蛎（蒸馏水洗净），加入50mL预先冷却的0.01mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5，含0.1mol/LNaCl），（两组一起）于高速组织捣粹机匀浆1min，于冰箱4℃放置1h进行抽提。(2)室温离心，4000r/m20min，收集离心上清液，（两组分开）并量体积。（留2mL上清液，待测酶的比活力。）(3)在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100mL加入20.9g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置0.5h。(4)室温离心，4000r/m20min，收集离心上清液，并量体积。（留2mL上清液，对0.01mol/LTris-HCl缓冲液pH7.5含0.1mol/LNaCl透析平衡，待测酶的比活力。（不做））(5)0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100mL加入23.8g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2h。(6)室温离心，4000r/m20min，收集沉淀物。(7)得到沉淀物，溶于5mL含0.1mol/LNaCl的0.01mol/LTris-HClpH7.5。装入透析袋，对0.01mol/LTris-HClpH7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测出为止（可用一定浓度BaCl2溶液检验）。(8)取出酶溶液，冷冻高速离心（0℃25000r/m30min）。(9)离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入棕色瓶于4℃冰箱保存。20g牡蛎加入50mL预先冷却的0.01mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5，含0.1mol/LNaCl），于高速组织捣粹机匀浆1min，于冰箱4℃放置1h进行抽提。室温离心，4000r/m20min，收集离心上清液，并量体积。匀浆液上清液缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100mL加入20.9g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1h。室温离心，4000r/m20min，收集离心上清液，并量体积。加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100mL加入23.8g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2h。室温离心，4000r/m20min，收集沉淀物。0.35饱和硫酸铵上清液沉淀溶于5mL含0.1mol/LNaCl的0.01mol/LTris-HClpH7.5。装入透析袋，对0.01mol/LTris-HClpH7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测出为止粗酶液2.2比活力测定2.2.1对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）：取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作。管号01234567pNP含量(mol)00.050.100.150.200.250.300.350.5mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.60.7H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.20.1Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mLOD405nm以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。＝8.80×103(mol/L)-1﹒cm-1管号空白1235mMpNPP(mL)各0.2mLNa2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mLH2O(mL)各0.50mL混匀，37℃，5分钟酶液（mL）/各0.1mL37℃，精确反应10分钟0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mL酶液（mL）0.1mLOD405nm2.2.2酶活力的测定以0号管调零点，测定各管的OD405nm值，从对照标准曲线求出产物的mol数，算出酶活力。管号11'22'33'44'55'加酶时间（min）0.5m1m1.5m2m2.5m3m3.5m4m4.5m5m加NaOH时间10.51111.51212.51313.51414.515反应时间（min）101010101010101010102.2.3蛋白浓度的测定本实验采用紫外吸收法（OD280）测定蛋白浓度。上述分离提取的三步酶制剂按一定比例用Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋白浓度高低而定。（一般稀释5-10倍）。2.3结果处理AVC=(mg/mL)VtB=(U/mL)21蛋白浓度酶活力计算：式中：A为稀释倍数，B为由标准曲线查得的pNPmol数，t为反应时间，C为由标准曲线查得的蛋白mg数，V1为测定酶活力所用的酶量(mL数)V2为测定酶活力所用的酶量(mL数)酶的比活力（U/mg）＝纯化倍数=各步比活力/第一步比活力得率%=各步总活力*100/第一步总活力酶活力（U/mL）蛋白浓度（mg/mL）将测定的数据或计算结果用下表记录。（本实验不做）步骤总体积mL蛋白mg/mL总蛋白mg酶活力U/mL总活力U比活力U/mg纯化倍数得率%匀浆过滤液4007.2420.3正丁醇处理上清液47033.80.35饱和(NH4)2SO4上清液44035.30.7饱和(NH4)2SO4沉淀溶解透析上清液40.3314.7DEAE-32酶液9.63.821002.2SephadexG75酶液13.20.49451.5SephadexG200酶液6.80.21509.33.注意事项（1）在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。（2）测活时可以将待测定的试管置于试管架放入水浴锅中预热及反应。（3）紫外分光光度测定需用石英杯。（4）稀释倍数（5）移液器的使用（6）离心机的使用