6种中草药对马拉色菌的影响

学科分类号（二级）18021本科学生毕业论文（设计）题目6种中草药抗马拉色菌的体外药敏试验姓名李繁梅学号094120086院、系生命科学学院专业生物科学指导教师张田职称（学历）副教授（硕士研究生）１6种中草药抗马拉色菌的体外药敏试验出生日期：1990年6月12日出生地：云南省曲靖市会泽县QQ：269382864电子邮箱：[e-mail]手机号码：[phone]专业：生物科学摘要..........................................2关键词........................................2材料、设备及仪器..............................2方法..........................................3结果..........................................4讨论..........................................5参考文献......................................6英文题目、摘要及关键词........................7２摘要：马拉色菌是一种条件致病性真菌，它会引起花斑藓、马拉色菌毛囊炎、银屑病、脂溢性皮炎等。目的：是筛选有效抑制马拉色菌的中草药。方法：采用微量稀释法与贴片法进行体外药敏实验。结果：6种中草药（侧柏叶、三颗针、黄芩、丁香、何首乌、胡黄连）中侧柏叶和三颗针对马拉色菌有较强的抑制作用；黄芩和丁香对马拉色菌有一定的抑制作用；何首乌和胡黄连对马拉色菌没有抑制作用。关键词：中草药；马拉色菌；抑制作用；抑菌圈马拉色菌（Malassezia)是人类及温血动物的正常菌群。是一种条件性致病性真菌，常驻皮肤的表面，具有酵母态和菌丝态。研究表明，该菌属与花斑糠诊、马拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特应性皮炎及一些银屑病的发生、发展密切相关[1]。到二十世纪中期，人们基于形态学、超微结构、生理生化特征以及分子生物学的研究，将马拉色菌分为厚皮马拉色菌（M.Pachydermatis)、合轴马拉色菌(M.sympodialis)、糠秕马拉色菌(M.furfur)、钝性马拉色菌(M.obtusa)、球形马拉色菌(M.globosa)、限制性马拉色菌(M.restricta)、斯洛菲马拉色菌(M.slooffiae)等七种[2-3]。近年来，Sugita等利用巢式PCR及PCR限制性片段长度多态（RFLP）等又发现3个新菌种。随着现在临床上所用的纯西药抗头皮屑药物如氟康唑、酮康唑等对此虽有一定的效果，但从高效低毒以及耐药性等方面的评价，没有一种药物能够令人满意。抗真菌中药的筛选研究已开展多年，相比传统的唑类药物具有不良反应小、来源广、价格低廉、较小出现耐药等优点。开展针对马拉色菌的体外药敏实验筛选中药，能够指导临床医生合理用药已受到越来越多的关注。1材料、设备及仪器1.1菌株马拉色菌预计（35株），取自正常人1.2培养基橄榄油培养基：蛋白胨10g、葡萄糖40ml、酵母浸膏0.1g、单硬脂酸甘油酯2.5g、吐温-80（重庆川江化学试剂厂；PH（50g/L,25℃):5.0-7.0)2.0ml、橄榄油（oliveoil（折光率：1.468-1.471；皂化值：175-195；酸价：1-3；碘值：79-88）以不饱和脂肪酸为主;中国科学院昆明植物研究所)40g、琼脂18g、水1L[8]。1.3药品：侧柏叶、三颗针、丁香、黄芩、何首乌、胡黄连。1.4阳性对照药品酮康唑（口服抗真菌药，片装，每片含酮康唑0.2g；生产厂家：西安杨森制药有限公司；产品批号：090115144；批准文号：国药准字H10930212.），储备液用二甲基亚砜溶液配制。基于以往研究结果，配制酮康唑储备液质量浓度为320mg/l，氟康唑储备液质量浓度为1280mg/l。使用以前用无菌水稀释10倍。1.5设备及仪器３1.5.1设备电子天平，超净工作台，恒温烘箱，显微镜，手提式压力蒸汽灭菌锅(生产厂家：浙江新丰医疗器械有限公司），超声震荡机(UltrasonicCleaner,型号：DAS300-GL2-16L)。1.5.2仪器锥形瓶，小烧杯，玻璃棒，注射器，小勺，培养皿，移液枪，载玻片，盖玻片，滴管，量筒，小药瓶（容量：5ml和10ml)，微孔过滤器，打孔器。2.方法2.1配制培养基（100ml）具体步骤如下：在每次配制培养基之前都要对培养皿进行灭菌处理；2.1.1称量:蛋白胨：1g；葡萄糖：4g；酵母菌膏：0.01g；单硬脂酸甘油脂：0.25g；吐温80：0.2ml；橄榄油：4ml；氯霉素：0.005g蒸馏水：100ml2.1.2定容到100ml2.1.3灭菌：高压121℃,40min灭菌。2.1.4倒平板:培养皿规格：100mm；高度：20mm；生长面积：55cm2。2.2对头皮屑进行镜检2.2.1配制体积分数为10%的KOH溶液和50%的双翎墨水（昆明市墨水厂出品）溶液2.2.2头皮屑经体积分数为10%KOH溶液处理，再用体积分数为50%的翎墨墨水溶液染色后在光镜下观察。2.3菌种的培养2.3.1将头皮屑拨至预先消毒的纸片上，淋洒少量体积分数为75%的酒精于头皮屑上，待酒精挥发干后用无菌接菌针拨落头皮屑接种到含氯霉素的抗性橄榄油培养基上。在34℃倒置培养了6天。2.3.2再次对培养出来的菌种进行鉴定2.4菌种的传代培养2.4.1将菌种稀释为四个浓度梯度用移液枪接种到编好号的培养基中,用涂布器涂布均匀,放在34℃的恒温箱中进行培养,培养3天后,再一次进行传代培养。2.4.2菌种的保存：斜面划线法进行接种培养，培养两天后放在4℃的冰箱里进行保存备用。2.5药品的提取及灭菌2.5.1超声提取2.5.1.1称取药品：何首乌、黄芩、三颗针和侧柏叶的粉末各5g放入塑料袋中每个塑料袋中加入50ml的蒸馏水，并密封。2.5.1.2超声提取：①接通电源；②调模式（MOOE）调时间（SETTIME）：20min；调温度（SETTEMP）：50℃③温度到50℃后，把药品放入超声提取机中，４进行提取。2.5.1.3过滤：滤网+烧杯进行过滤2.5.1.4离心：药液放入离心管中，配平，离心，离心后取上清液，放入药瓶中。2.5.1.5巴氏消毒法进行灭菌：超声提取机中进行，调温度为60℃，把药品放入其中，时间为30min。2.5.1.6阳性药物的制备：阳性药品酮康唑用二甲基亚砜稀释，初始浓度为40mg/ml；最适初始浓度为0.032mg/ml.用微孔过滤（微孔滤膜的孔径是0.45um,规格是Φ25m/m批号：2012年4月8日，生产厂家：上海兴亚净化材料厂）的方法来进行灭菌。2.5.2煮沸法称取药品：何首乌、黄芩、三颗针和侧柏叶各2g放入塑料袋中每个塑料袋中加入10ml的蒸馏水，并密封。用沸水煮15min,过滤、离心;巴氏消毒法进行灭菌。2.6接种:贴片法2.6.1配制培养基2.6.2药液的稀释：把药液用无菌水稀释10倍，即初始浓度为10mg/ml(1ml药液+9ml无菌水）；把稀释用的小药瓶分别编号：1，2，…10；1号加入1000ul的药液，2～10加入500ul的无菌水，自第一孔吸500ul的药液加入2号小药瓶中，混匀，并依次递倍稀释，每个小药瓶中放入3片滤纸片(直径R为6mm)进行浸泡，用一个小药瓶装500ul的蒸馏水并放入14片滤纸片(直径R为6mm)浸泡，用一个小药瓶(容量：5ml)装500ul的菌液并放入14片滤纸片浸泡，2.6.3涂布：一种药设置3个平行对照组，每个培养基上都做好标记并编号；用稀释好的菌液进行涂布，在涂布时注意用具的灭菌。共重复5次。2.6.4贴滤纸片：在相应的培养基上对应着编号进行贴片。2.6.5培养:34℃培养72h，每天观察菌体生长情况，以菌体生长对照生长是否良好为标准。2.6.6结果判读：肉眼观察到菌体生长对照孔菌落生长良好，有菌落生长为无抑制作用，无菌落生长为有抑制作用。用游标卡尺来测量抑菌圈的大小。2.7质控方法：每次试验的同时，以两种方法进行敏感性测定。每次结果显示其MIC总是介于同一范围，且各药物每次测定的MIC值波动不超过一个稀释度，方认为实验操作准确无误。3结果3.1头皮屑镜检结果：看到一些蓝紫色的点。孢子壁厚、单级出芽；初步判断为马拉色菌。3.2对培养出来的菌种进行鉴定：培养出了两种真菌菌落。3.2.1肉眼观察：3.2.1.1第一种第1天无菌落出现，第2天出现菌落；刚开始时菌落呈乳白色，５后来逐渐变成黄褐色，符合马拉色菌的形态特征[12]。3.2.1.2第二种第1,2天无菌落出现，第3天出现菌落，但菌落如同长在培养基内部一样，不符合马拉色菌的生理特性，到了第6天仍然没有变色，一直是乳白色，不符合马拉色菌的形态特征[12]。3.2.2镜检3.2.2.1第一种在视野中出现蓝紫色的点,判断为马拉色菌的孢子丝,出芽方式为单极出芽,判断为马拉色菌。3.2.2.2第二种在视野中出现紫红色的点,看不出出芽的方式,且孢子丝的直径与马拉色菌的直径不符,因此判断不是马拉色菌。综合判断第一种真菌为马拉色菌。3.3药敏试验结果阳性对照组的抑菌效果明显；何首乌和胡黄连对马拉色菌无抑制作用；黄芩、丁香对马拉色菌有一定的抑制作用。三颗针和侧柏叶对马拉色菌有明显的抑制作用。实验结果如表一所示。三种方法进行中草药的提取，超声提取用了两种方法：蒸馏水提取和50%乙醇提取；用50%的乙醇提取的效果较好。与煮沸法相比，黄芩用煮沸法提取的效果较好；侧柏叶、三颗针和丁香用50%乙醇超声提取的效果较好。表一6种中草药对马拉色菌的抑制作用有无抑菌圈抑菌圈大小r（平均值）抑菌范围最小抑菌浓度阳性对照（酮康唑）有9.15mm0.03mg/ml～0.05mg/ml0.03mg/ml侧柏叶有8.53mm0.078mg/ml～5mg/ml0.078mg/ml三颗针有8.36mm0.312mg/ml～2.5mg/ml0.312mg/ml黄芩有7.70mm2.5mg/ml～5mg/ml2.5mg/ml丁香有7.76mm0.625mg/ml～1.25mg/ml0.625mg/ml何首乌无000胡黄连无000备注：r为半径，数据是3次重复实验（每次实验有3个平行样）取平均值所得。６表二各种浓度中草药溶液对马拉色菌的抑制作用中草药各种浓度（mg/ml)的中草药溶液下抑菌圈大小r（mm）1052.51.250.6250.3120.1560.078侧柏叶08.96±0.0238.85±0.0238.77±0.0258.74±0.0378.57±0.0138.42±0.0288.43±0.041三颗针008.45±0.0208.36±0.0228.33±0.0278.32±0.01900黄芩07.67±0.0217.75±0.02500000丁香007.80±0.0197.74±0.0467.75±0.0190004.讨论近年来，由于马拉色菌所引起的疾病越来越多的被人们认识，因此人们对马拉色菌的研究也日益受到重视。最近，Gueho等[2]通过形态学、生理生化以及分子生物学的研究认为该菌可分为7个种。中药抗白色念珠菌、红色毛廯菌等真菌作用的研究已经有较多的报道[5]，但是对中草药对马拉色菌的抑制作用的报道却不多。因此研究中草药对马拉色菌的抗菌作用在现实生活中有着重要的意义。本实验只是对中草药抗马拉色菌体外药敏试验的初筛试验，没有对培养出来的马拉色菌进行分型鉴定。实验中，在配制培养基时加入了橄榄油和吐温-80这两种马拉色菌生长所必需的营养物质，为马拉色菌创造了良好的生活环境。但在培养基中加入橄榄油如果配制成液体培养基的话，橄榄油会漂浮在培养基的表面从而影响到结果的观察，不利于实验的进行，因此采用固体培养的方法来进行。配制培养马拉色菌的固体培养基平板时，要边倒边摇匀，不然在培养基的表面容易出现白色的油滴，影响对马拉色菌的培养与观察。实验结果显示，在7中中草药中侧柏叶和三颗针对