6第六章基因的分离与鉴定

第六章基因的分离与鉴定基因的分离与鉴定方法真核生物基因克隆的实例染色体自主复制顺序的分离与鉴定着丝粒DNA的分离与鉴定端粒DNA的分离与鉴定第一节基因的分离与鉴定方法一，获得基因的一般方法1.化学合成法主要用于较小基因合成，或需改变密码子的基因。2.半化学合成法mRNA→cDNA→加人工接头/合成一段DNA→与载体相连3.筛选法用于各种方法从基因组文库中选择目的基因。4.采用PCR技术从基因组或总RNA扩增基因。二，基因的筛选方法1.遗传互补法（1）原理当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带有决定新性状的遗传基因。①营养缺陷型受体细胞+外源细胞→转化细胞涂布在合成基本培养基上→原养型细胞生长②受体细胞（无某种表型）+外源DNA→转化细胞涂布在特殊培养基上→具有新性状细胞③虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，也可用于基因筛选实例①基因组文库DNA→转化酿酒酵母细胞（Leu-）→转化细胞（Leu+）→LEU基因②基因组文库DNA→转化E.coli（无纤维素酶活性）→转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈→纤维素酶基因优点：简便，快速，可靠，首选方法，获得的基因一定是完整的基因缺点：适用范围较窄，酵母菌的基因能使E.coli缺陷型互补，有的高等植物的cDNA文库也能使E.coli营养缺陷型互补。必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。（2）分离步骤分离纯化基因组文库重组DNA分子→转化适当的宿主细胞→涂布在选择培养基上→随机挑选阳性克隆，分别重组DNA分子→再转化相同受体细胞→高频转化子→基因的进一步证实和鉴定2.核酸杂交法（1）原理利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交的特定分离目的基因，蛋白质的基因在不同的生物中具有保守性。优点：不需要基因表达必备条件：合适的核酸探针或有关资料，外源DNA能在宿主细胞中扩增。（2）核酸探针的种类①DNA探针②寡核苷酸探针③cDNA探针④RNA探针（3）分离步骤基因文库→制备DNA样品膜→与标记探针杂交→杂交斑点（阳性克隆）→分离重组DNA分子→作斑点和Southern杂交确认杂交结果→DNA进一步证实和鉴定，核酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；分离插入片段进行基因表达，用免疫法或其他方法检测表达产物3.免疫法（1）原理外源DNA引入宿主细胞后表达出蛋白质，此为抗原与相应的抗体发生免疫反应，然后利用二抗与一抗反应，用二抗偶联的酶反应筛选目的DNA。优点：不依赖于基因表达产物的生物学活性必备条件：待分离基因的表达产物蛋白质，必须纯化和用于制备相应抗体。（2）分离步骤基因文库→蛋白质样品膜制备→免疫法筛选→有色斑点（阳性克隆）→进一步证实：分离阳性克隆无细胞抽提物，作斑点印迹，Western印迹4.染色体步查法（1）原理利用DNA探针筛选对应重组DNA，然后以插入片段两端片段为探针。优点：可获得染色体中一段DNA的限制酶图谱，对基因组全序列测定十分有用。缺点：工作量大，鉴定困难。必要条件：两基因间距离清楚。