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GeneTechBiotechnologyLimitedCompany上海晶泰生物技术有限公司地址：上海市桂箐路69号25号楼6楼电话：64957570Affymetrix表达谱芯片实验培训手册2006年7月1目录一总RNA的提取和纯化1.提取总RNA2.总RNA的定量和质检3.纯化总RNA4.纯化总RNA的定量和质检二CDNA的合成和纯化1.1stcDNA的合成2.2ndcDNA的合成3.纯化双链cDNA三IVT合成cRNA和cRNA的纯化1.IVT合成cRNA2.纯化cRNA3.cRNA的定量和质检四cRNA片段化、配制杂交液1.片段化cRNA2.片段化cRNA的质控3.配制杂交液五芯片杂交1.预杂交芯片2.杂交液的准备3.杂交芯片六洗脱芯片七扫描芯片2一总RNA的提取和纯化1.提取总RNA（要求最低1－8ug）a.提取（用Invitrogen的TRIzol提取）I.如果是TRIzol保存的细胞直接进行II步；如果是组织，在液氮中研磨成粉末。II.待液氮挥发干，立即加入TRIzol，每100mg组织加1mlTRIzol，融化后，用加样枪反复吸吹，使样品充分裂解，移入1.5ml离心管中，室温静置3～5分钟。III.在离心管中每1mlTRIzol起始量加200ul氯仿，振荡混匀。IV.将离心管在4℃,12000rcf，离心15分钟。V.用移液器小心吸出上层水相，加入另一离心管中，每mlTRIzol起始量加入500ul异丙醇。VI.－20℃,沉淀35min以上。VII.4℃,12000rcf，离心10分钟。VIII.小心移出上清。IX.沉淀中加入1mL75%乙醇，4℃,12000rcf，离心10分钟。X.重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀。XI.去上清，稍微晾干，RNA略显透明，加入适当体积（30ul）的RNase-free的水，充分溶解。2.定量和检测总RNAa)紫外定量和检测I.用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD=40ug/ml。II.根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度,纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。b)变性胶电泳质检I.配制1.2%的电泳胶10×MOPSGelBuffer10mlAgrose1.2gRNase-FreeWater90ml加热溶解Agrose，稍微冷却，加入37%甲醛1.8mlEB(10mg/ml)1ul摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1×MOPSGelBuffer中平衡10分钟，待用。II.样品变性5×LoadingBuffer2ulRNA样品1ugRNase-Freewater调节至10ul在65℃，变性5分钟，立即置于冰上冷却。III.电泳将处理好的RNA样品，稍微离0心，70V恒压电泳1小时。在凝胶成像仪上观察结果。3C）生物分析仪分析RNA完整性3.纯化总RNAQIAGEN的RNeasyMiniKit（总RNA量大于45ug）或MicroKit（总RNA量小于45ug）。RNeasyMiniKitI.将总RNA的体积用RNase-free的水调整到100ul，(因QIAGEN纯化柱的最大上样量为100ugRNA，所以一般取RNA不大于100ug)。II.加入350ulRLT工作液(1mlRLT中加10ulbeta-ME，混匀而成)，充分混匀。III.加入250ul无水乙醇，充分混匀(不要离心)。IV.将混好的700ul样品加到QIAGEN纯化柱中，8000rcf，离心15秒。V.弃滤液，加入500ulRPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，8000rcf，离心15秒。VI.弃滤液，加入500ulRPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，8000rcf，离心2分钟。VII.将纯化柱放入一个新的收集管，最大转速，离心1分钟。VIII.将纯化柱换入一个EP管中，在纯化柱膜中间加30ulRNase-free的水，室温放置1分钟，最大转速，离心1分钟。IX.将EP管中的样品移入一个新的EP管中。RNeasyMicroKit1将总RNA的体积用RNase-free的水调整到100ul。2加入350ulRLT工作液(1mlRLT中加10ul2-ME，混匀而成)，充分混匀。3加入250ul无水乙醇，充分混匀(不要离心)。4将混好的700ul样品加到QIAGEN纯化柱中，＝8000rcf，离心15秒。5弃滤液，加入500ulRPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，8000rcf，离心15秒。6弃滤液，加入500ul80%酒精，＝8000rcf，离心2分钟。7将纯化柱放入一个新的收集管，最大转速离心5分钟。8将纯化柱换入一个EP管中，在纯化柱膜中间加14ulRNase-free的水，室温放置1分钟，最大转速，离心1分钟。4.纯化总RNA的定量和检测a紫外定量和检测:总RNA的浓度和OD260/OD280。b变性胶电泳质检:4二cDNA的合成和纯化1.1stcDNA的合成(Affymetrixone-cyclecDNASynthesisKit)a)总RNA1～8ugRNase-freewater补至8ulb)T7-(dT)24Primer(50uM)2ul稀释好的poly-Acontrol2ul混匀，70℃温浴10分钟，置于冰上至少2分钟，离心片刻；c)5×1stStrandBuffer4ulDTT(0.1M)2uldNTP(10mM)1ul混匀，42℃，温浴2分钟；a)SuperScriptIIRT(200U/ul)1uL(1~8ug起始)b)混匀，42℃,温浴1小时。2.2ndcDNA的合成(Affymetrixone-cyclecDNASynthesisKit)a)将1stcDNA合成产物置于冰上，加入下列试剂：ComponentVolumeRNase-Freewater91ul5×2ndStrandBuffer30uldNTP(10mM)3ulE.coliDNALigase(10U/ul)1ulE.coliDNAPolymerase(10U/ul)4ulE.coliRNaseH(10U/ul)1ulTotalVolume130ul混匀，16℃，反应2小时；b)加入2ulT4DNAPolymerase，混匀，16℃，5分钟；c)加入10ulEDTA(0.5M)，混匀，终止反应。-20℃保存或进行下步纯化。3.纯化cDNA(AffymetrixGeneChipSampleCleanupModule)a)将600ulcDNABindingBuffer加入cDNA合成产物中，振荡混匀3秒。b)将500ul液体移入cDNACleanupSpinColumn管中，不要振荡，=8000rcf,室温离心1分钟，弃滤液。c)将剩余液体移入cDNACleanupSpinColumn管中，不要振荡，=8000rcf,室温离心1分钟，弃滤液。d)换一个新收集管，加入750ulcDNAWashBuffer，最大转速离心1Min，弃滤液。5e)打开盖子，最大转速离心5Min，弃滤液。f)将柱子转移至1.5mL的收集管中，加入14ul的cDNAElutionBuffer。室温静置1分钟，最大转速离心1分钟。三cRNA的合成和纯化1.IVT合成cRNA(GeneChipIVTLabelingKit)ReagentVolumeTemplatecDNA12ulRNase-Freewater8ul10×IVTLabelingBuffer4ulIVTLabelingNTPMix12ulIVTLabelingEnzymeMix4ulTotalVolume40ul混匀，稍离心，37℃温浴16小时。合成产物可保存在-20℃或直接进行下一步纯化。2.纯化cRNA（GenechipSampleCleanupModule）1加入60ulRNaseFree水，振荡混匀3秒。2加入350ulIVTcRNAbindingBuffer,振荡混匀3秒。3加入250ul无水乙醇，用加样枪混匀。4将以上混合液加入cRNACleanupSpinColum,=8000rcf,离心15’’，弃滤液。5将柱子移至1.5mL的收集管，加入500ul的IVTcRNAWashBuffer,=8000rcf,离心15’’，弃滤液。6加入500ul80%乙醇,=8000rcf,离心15’’，弃滤液。7换一个收集管，打开盖子，16000rcf,离心5min，弃滤液。8将柱子转移至1.5mL的收集管，加入11ul的RnaseFree水，16000rcf1min。9加入10ul的RnaseFree水，16000rcf1min。cRNA的定量和检测a.用紫外分光光度计测量cRNA的浓度和OD260/OD280：b.变性胶检测cRNA：取2ugcRNA在1.2%的变性胶上电泳，纯化的cRNA应该呈弥散状长条带。6四cRNA片段化、配制杂交液1.片段化cRNAa.校正cRNA浓度根据公式：[校正cRNA]=[cRNA]×V-M×RV[cRNA]：cRNA的测量浓度；V：cRNA的洗脱体积；M：合成cRNA时所用总RNA的量；R：cRNA的回收得率；[校正cRNA]：cRNA校正后的浓度。b.配制片段化反应体系根据校正cRNA的浓度片段化(30ul)：cRNA15ug5×FragmentationBuffer6ulRNase-FreeWater补充至30ulc.片段化混匀，94℃温浴35分钟，之后置于冰上。d.片段化cRNA的质检：变性胶电泳质检，片段化cRNA约为35～200bp。2.配制杂交液根据芯片类型按下表配制适当量的杂交液：配方300ul终浓度1片段化cRNA(0.5mg/ml)30ul0.05ug/ul2OligoB2对照(3nM)5ul50pM320×Hybridizitioncontrol15ul1×4鱼精DNA(10mg/ml)3ul0.1mg/ml5乙酰化BSA(50mg/ml)3ul0.5mg/ml62×杂交Buffer150ul1×7DMSO30ul8RNase-FreeWater64ul7五芯片杂交先进行测试芯片的杂交、洗染和分析，根据测试芯片的结果再杂交表达谱芯片。1和2同时进行，直到第3步：1.预杂交芯片I.取出芯片，平衡至室温；II.加入1×杂交Buffer；III.45℃，60rpm，预杂交10分钟。2.杂交液的准备I.杂交液混匀，离心片刻；II.99℃，温浴5分钟；III.将杂交液转至45℃，温浴5分钟；IV.离心机最大转速(16000rcf)离心5分钟。3.杂交芯片I.吸出芯片中的1×杂交Buffer；II.将杂交液加入到芯片中；III.45℃，60rpm，杂交16小时；杂交结束后，吸出芯片中的杂交液，加入洗液A，进行后面的洗染过程。六洗脱芯片在洗脱工作站上按照芯片类型，运行洗脱程序。七扫描芯片扫描仪上扫描芯片。八数据分析(参考)1．应用GCOS软件进行数据分析。2．Scaling方法：将芯片所有探针组的Signal从小到大排序，去掉最大的2％和最小的2％后，将剩下探针组的平均信号值调整到500。8常用试剂配制1电泳试剂1)10xFAgelbufferMOPS41.9gNaAc6.8gEDTA(0.5M,pH8.0)20mlNaOH调PH7.0，RNasefreeH2O调至1000ml2)1XFAgelrunningbuffer(500ml)10xFAgelbuffer50ml37%甲醛（formaldehyde）10mlRNasefreeH2O440ml3）5Xloadingbuffer(10ml)溴酚兰25mgEDTA(0.5M,pH8.0)80ul37%甲醛（12.5M）750ul甘油2ml甲酰氨(formamide)3.084ml10xFAgelbuffer4ml4)电泳槽冲洗液NaOH2g0.5MEDTA1mlDIH2O500ml5）Gel：琼脂糖1.2g10xFAgelbuf