核酸的生物合成

第九章核酸的生物合成中心法则生物的遗传信息从DNA传递给mRNA的过程称为转录。根据mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程，被称为翻译和表达。1958年Crick将生物遗传信息的这种传递方式称为中心法则。DNARNA蛋白质转录反转录翻译复制复制Reversetranscription第一节DNA的生物合成一、DNA的半保留复制复制时期1.半保留复制的证明2.DNA生物合成的基本问题模板引物dNTPDNA聚合酶Mg2＋在5’-3’方向延伸二、原核细胞DNA的复制合成1.原核DNA聚合酶2.复制的复杂性5’5’3’3’酶作用DNA聚合酶Ⅰ5‘－3’聚合酶及外切酶作用，3‘－5’外切酶酶作用，可校正/修复DNA链，还可切除引物DNA聚合酶Ⅱ5‘－3’聚合酶及3‘－5’外切酶酶作用，可校正/修复DNA链DNA聚合酶Ⅲ与酶Ⅰ作用类似，酶活高，是主要的链延伸酶（聚合酶replicase）冈崎片段与半不连续复制（okazaki1968年）复制方向：单起点、双向或单向复制引物（primer）及引物酶(primase)引物的切除与连接5’－3’外切酶切除引物（DNA聚合酶Ⅰ）DNA连接酶（大肠杆菌DNA连接酶/T4连接酶）复制的起始辨识起点（富含AT区）解旋（拓扑异构酶）解链单链结合蛋白（SSB）三、真核DNA的复制合成真核DNA的合成的基本过程类似于原核DNA，不同之处：多复制起点至少有五种聚合酶αβγδε端粒的复制依赖于端粒酶真核生物DNA聚合酶αβγδε亚基数44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－功能复制、引发修复复制复制复制DNA复制过程真核生物DNA复制叉结构示意图四、反转录作用（RNA指导下的DNA合成）1970年，Temin和Baltimore在致癌RNA病毒中发现了反转录酶（ReverseTranscriptase）1.DNA聚合酶特性需引物（tRNA）、dNTP、模板（RNA、DNA）、5’-3’方向聚合2.杂交分子H键断开常由核糖核苷酶H（RNAaseH）专一切除RNA-DNA分子中的RNA,全部或部分去除RNA3.前病毒DNA合成的DNA链称负链,然后由依赖DNA的DNA聚合酶催化下,以负链为模板合成一正链这样形成的DNA称前病毒DNA,前病毒DNA可嵌入宿主细胞DNA中(称整合)或潜伏于宿主细胞用其负链(依赖DNA的RNA聚合酶)出RNA,合成外壳蛋白.1五、DNA的损伤与修复1.DNA的损伤与突变损伤可造成突变或致死突变（mutation）：指一种遗传状态，可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变。携带突变基因的生物称为突变体，未突变的称为野生型。损伤原因物理（紫外（见下页）、高能射线、电离辐射）化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）生物因素（碱基对置换、碱基的插入/缺失造成移码）当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如TT二聚体。2.DNA损伤修复光复活切除修复重组修复SOS修复光复活（photoreactivation）可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。切除修复（excisionrepair）即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使DNA恢复正常。这是一种比较普遍的修复机制。细胞的修复功能对于保护遗传物质DNA不受破坏有重要意义。重组修复（recombinationrepair）又称复制后修复（postreplicationrepair）受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。SOS修复指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error-ProneRepair）。3.基因重组与DNA克隆（基因工程）限制性内切酶能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶分布：主要在微生物中。特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有400～500多种。运载体种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。质粒的特点:细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子；质粒是基因工程中最常用的运载体；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；质粒的存在对宿主细胞无影响；质粒的复制只能在宿主细胞内完成。DNA重组与克隆①从细胞中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③分离大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因⑦重组体的筛选PCR(polymeraseChainreaction)聚合酶链式反应PCR也称体外酶促基因扩增，原理类似天然DNA复制。靶DNA分子变性后解链，两条单链DNA分别与两条引物互补结合，在4种dNTP存在和合适和条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶催化引物由5’－3’扩增延伸，形成两条新的双链DNA分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变性、复性、延伸循环，模板DNA增加一倍。经过30～50个循环，可使原DNA量增加106～109倍。PCR的主要步骤：•模板DNA的变性一般选用95℃左右1min，使DNA双链解为单链•复性按引物实际情况确定适当温度，时间一般30s至1.5min•延伸一般72℃1min•循环数按初始模板浓度确定，一般25－45之间PCR的引物设计PCR扩增产物的特异性主要由引物决定，引物的设计是PCR成功的关键，•引物位置和产物长度根据不同目的和要求确定，长度一般在200～800bp之间•引物的长度一般为18～25bp•末端核苷酸3’端不得有任何修饰•G＋C含量和Tm值一般在40－60%之间，两条相差2－3℃第二节RNA的生物合成DNA携带的遗传信息（基因）传递给RNA分子的过程称转录（transcription）。在生物界，RNA合成有两种方式：一是DNA指导的RNA合成，此为生物体内的主要合成方式。另一种是RNA指导的RNA合成，此种方式常见于病毒。转录产生的初级转录本是RNA前体（RNAprecursor），需经加工过程（processing）方具有生物学活性。反应体系：DNA模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+，合成方向5'→3'。连接方式--3',5'磷酸二酯键。转录特点：不对称转录--DNA片段转录时，双链DNA中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录。模板链(templatestrand)及反意义链(antisensestrand):指导RNA合成的DNA链为模板链，又称反意义链。编码链(codingstrand)及有意义链(sensestrand)：不作为转录的另一条DNA链为编码链，又称有意义链。由于基因分布于不同的DNA单链中，即某条DNA单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。原料：四种磷酸核苷NTP,DNA中的T在RNA合成中变为U合成过程:连续，方向：5‘→3’从头合成,5´—末端的起始核苷酸常为GTP或ATP一、转录基本特点不对称转录“转录单位”（transcriptionunit）以操纵子（operon）为转录的功能单位,结构上包括四个功能区：多顺反子（结构基因区）、启动子、操作子、终止子和调节基因。原核RNA聚合酶转录过程二、原核细胞RNA转录合成特点调节基因启动子操纵基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP复合物mRNA+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶forward大肠杆菌的RNA聚合酶全酶由5种亚基α2ββ’σ组成，σ因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与β’βα2分离，没有σ、亚基的酶称为核心酶——只催化链的延长，对起始无作用。五种亚基的功能分别为：α亚基：与启动子结合功能。β亚基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯键。亚基：在全酶中存在，功能不清楚。β’亚基：与DNA模板结合功能。σ亚基：识别起始位点。识别解链起始延伸终止1.起始位点的识别σ识别正确的启动位点，启动子的结构至少由三部分组成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）；第三部分是RNA合成的起始点。3’5’+1转录起始点AACTGTATATTATTGACATATAAT5’3’－35序列Sextama框－10序列Pribnow框2.转录起始加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，σ亚基就会被释放脱离核心酶。-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板链E3.链的延伸以NTP为原料和能量,DNA模板链为模板，靠核心酶的催化，核苷酸间通过3´,5´-磷酸二酯键成核糖核酸链(RNA)4.转录终止转录终止信号有两种情况弱终止子：依赖ρ因子（终止因子，terminators）的终止NusA蛋白识别DNA链上的终止信号，在ρ因子帮助终止。强终止子：（1）在终止点之前具有一段富含G-C的回文区域。（2）富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U（连续6个）。三、真核生物的转录作用酶类分布产物活性分子量(KDa)反应条件ⅠⅡⅢ核仁核质核质rRNA（5.8S、18S、28S）mRNAtRNA、5SrRNA50～70％20～40％10％500～700～700低离子强度要求Mg2+或Mn2+高离子强度高Mn2+浓度1.真核RNA聚合酶2.转录真核RNA转录基本过程与原核类似，但其产生的mRNA为“单顺反子”，只编码一条肽链。四、转录过程的选择性抑制剂放线菌素D利福平α－鹅膏蕈碱原核抑制抑制不抑制真核抑制不抑制抑制RNA聚合酶Ⅱ五、转录产物的“加工”（成熟过程）在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物（primarytranscript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。rRNA前体的转录后加工tRNA前体的加工真核mRNA前体的加工rRNA前体的加工rRNA基因之间以纵向串联的方式重复排列。加工过程：1、剪切作用：需核酸酶参与。2、甲基化修饰：修饰在碱基上。3、自我剪接：一种核酶的作用。原核rRNA加工：rRNA含非转录的间隔区，其产物中含tRNA真核rRNA加工：1.5S自成体系加工少无修饰和剪接。2.45S加工中含剪切和甲基化修饰，需核酸酶。大肠杆菌rRNA前体加工真核生物rRNA前体加工tRNA前体的加工tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子3’末端加上CCA碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用真核mRNA前体的加工剪接（Splicing）去除内含子，连接外显子5’帽端结构的生成（如图）3’端多聚A（polyA）的附加六、RNA的复制合成（RNA指导的RNA合成）噬菌体Qβ的RNA复制两阶段（1）其单链RNA可充当mRNA，利用寄主中的核糖体合成