8-2014-工作手册-第四章-第八节-非法添加物

第八节非法添加物1食品中苏丹红染料测定的标准操作程序食品中苏丹红染料测定的高效液相色谱法标准操作程序如下：1适用范围本程序规定了高效液相色谱法测定红辣椒粉等粉状样品、红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品、辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品、香肠等肉制品中苏丹红染料的条件和详细分析步骤。本程序适用于红辣椒粉等粉状样品、红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品、辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品、香肠等肉制品中苏丹红染料的测定。本程序的检测限为10μg/kg，定量限为30μg/kg。2原理苏丹红染料一般不溶于水易溶于有机溶剂，待测样品经有机溶剂提取，经浓缩及氧化铝柱层析萃取净化，用反相高效液相色谱—紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。3试剂3.1乙腈色谱纯3.2丙酮色谱纯、分析纯3.3甲酸分析纯3.4乙醚分析纯3.5正己烷分析纯3.6无水硫酸钠分析纯3.7层析柱管：1cm(内径)×5cm(高)的注射器管。3.8层析用氧化铝（中性100目～200目）：105℃干燥2h，于干燥器中冷至室温，每100g中加入2mL水降活，均匀后密封，放置12h后使用。3.9氧化铝层析柱：在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至3cm高，经敲实后加一薄层脱脂棉，用10mL正己烷预淋洗，洗净柱杂质后，备用。3.105%丙酮的正己烷溶液：吸取50mL丙酮用正己烷定容至1L。3.11标准物质：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ；纯度≥95%。3.12标准贮备液：分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏丹红Ⅳ各10.0mg（按实际含量折算），用乙醚溶解后用正己烷定容至250mL。4仪器与耗材4.1高效液相色谱仪（配有紫外可见光检测器）4.2分析天平：感量0.1mg4.3旋转蒸发仪4.4均质机或匀浆机4.5粉碎机4.6离心机4.70.45μm有机滤膜5操作步骤5.1样品制备：将液体、浆状样品混合均匀，固体样品需粉碎磨细。5.2样品处理：5.2.1红辣椒粉等粉状样品称取1g～2g（准确至0.001g）样品于三角瓶中，加入正己烷10mL～20mL，超声处理5min，过滤，用正己烷10mL洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5mL以下，慢慢加入氧化铝层析柱中，为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表面吸附的色素带宽宜小于0.5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用正己烷10mL～30mL洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60mL洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5mL，经0.45μm有机滤膜过滤后待测。5.2.2红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品称取0.5g～2g（准确至0.001g）样品于小烧杯中，加入约1mL～10mL正己烷溶解,难溶解的样品可于正己烷中加温溶解。然后按1中“慢慢加入氧化铝层析柱……经0.45μm有机滤膜过滤后待测”操作。5.2.3辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品称取10g～20g(准确至0.01g)样品于离心管中，加10mL～20mL水将其分散成糊状，含增稠剂的样品多加水，加入30mL正己烷：丙酮=3：1，匀浆5min，3000rpm离心10min，吸出正己烷层，于下层再加入20mL2次正己烷匀浆，过滤。合并3次正己烷，加入无水硫酸钠5g脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持5分钟，用5mL正己烷溶解残渣后，按1中“慢慢加入氧化铝层析柱……经0.45μm有机滤膜过滤后待测”操作。5.2.4香肠等肉制品称取粉碎样品10g～20g(准确至0.01g)于三角瓶中，加入60mL正己烷充分匀浆5min，滤出清夜，再以20mL2次正己烷匀浆，过滤。合并3次滤液，，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至5mL以下，按1中“慢慢加入氧化铝层析柱……经0.45μm有机滤膜过滤后待测”操作。5.3测定5.3.1色谱检测条件5.3.1.1色谱柱：ZorbaxSB-C183.5μm4.6mm150mm（或相当型号色谱柱）5.3.1.2流动相：溶剂A（85+15）0.1%甲酸的水溶液－乙腈溶剂B（80+20）0.1%甲酸的乙腈溶液－丙酮5.3.1.3梯度洗脱条件：见表1。表1梯度洗脱条件流速（mL/min）时间（min）流动相曲线A%B%1.002575线性1.010.02575线性1.0200100线性1.032.00100线性1.0302575线性1.040.02575线性5.3.1.4柱温：30℃5.3.1.5检测波长：苏丹红Ⅰ478nm；苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ520nm；于苏丹红Ⅰ出峰后切换。5.3.2标准曲线制备吸取标准贮备液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL，用正己烷定容至25mL，此标准系列浓度为0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56μg/mL，各进样量10μL，绘制标准曲线。5.3.3样品测定：吸取10μL样品处理液，按标准曲线制备检测色谱条件对样品进行测定。与标样对照，根据峰保留时间定性以及相应峰面积定量。5.4色谱图见图1。图1苏丹红色素色谱分离图6结果计算按式（1）计算样品中苏丹红含量。mvcX……………………（1）式中X——样品中苏丹红含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c——由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——样液定容体积，单位为毫升（mL）；1、苏丹红Ⅰ；2、苏丹红Ⅱ；m——样品质量（g）。7精密度重复测定的相对标准偏差小于10%。8说明不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将1μg/mL的苏丹红的混合标准溶液1mL加到柱中，用5%丙酮正己烷溶液60mL完全洗脱为准，4种苏丹红在层析柱上的流出顺序为苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅲ，可根据每种苏丹红回收率作出判断。苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏丹红Ⅲ的回收率偏低时表明活性偏高。2调味品中碱性橙、碱性玫瑰精、酸性橙Ⅱ及酸性金黄四种工业染料测定的标准操作程序调味品中碱性橙、碱性玫瑰精、酸性橙Ⅱ及酸性金黄四种工业染料测定的SPE-UPLC-MS/MS法标准操作程序如下：1适用范围本程序规定了调味品中碱性橙、碱性玫瑰精、酸性橙Ⅱ及酸性金黄工业染料的SPE-UPLC-MS/MS检测方法。本程序适用于调味品中碱性橙、碱性玫瑰精、酸性橙Ⅱ及酸性金黄单个或混合物残留量检测。本程序检测限：碱性橙、酸性橙Ⅱ和酸性金黄7.0μg/kg；碱性玫瑰精0.1μg/kg；定量限：碱性橙、酸性橙Ⅱ和酸性金黄20.0μg/kg；碱性玫瑰精0.3μg/kg。2原理以含50%甲醇、1%甲酸的50mmol/L乙酸铵水溶液作为提取溶液，利用WAX弱阴离子交换固相萃取柱（60mg，3mL）对样品进行净化，UPLC-Ms/Ms测定碱性橙、碱性玫瑰精、酸性橙Ⅱ及酸性金黄含量。采用基质加标工作曲线内标法外标法定量。碱性3试剂以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；试验用水均为超纯水。3.1甲醇，色谱纯。3.2乙酸铵，分析纯。3.3甲酸，分析纯。3.4氨水，优级纯。3.5提取溶液：50mmol/L乙酸铵水溶液含甲醇50%（v/v）、甲酸1%（v/v）。3.6固相萃取柱平衡溶液：50mmol/L乙酸铵水溶液含甲酸1%（v/v）。3.7淋洗溶液：50mmol/L乙酸铵水溶液含甲醇5%（v/v）、甲酸1%（v/v）。3.8洗脱溶液：5%（v/v）氨水甲醇。3.9样品稀释液：5mmol/L乙酸铵水溶液含甲醇50%（v/v）、甲酸0.1%（v/v）。3.10标准品碱性玫瑰精(RhodamineB)、酸性橙Ⅱ钠盐（OrangeⅡsodiumsalt）标准品（Dr.EhrenstorferGmbh）；碱性橙（ChrysoidineG）、酸性金黄（MetanilYellow）标准品（StandardFluka）3.11工业染料标准储备液准确称取0.0100克碱性橙、玫瑰精、酸性橙Ⅱ和酸性金黄标准品，用50%甲醇水溶液溶解并定容至10.0mL。-20℃以下保存，有效期为一年。3.12标准系列配制碱性橙、碱性玫瑰精、酸性橙和酸性金黄G混合标准系列，碱性橙Ⅱ、酸性橙和酸性金黄浓度为：0.4、0.8、2.0、3.2、4.0μg/mL；碱性玫瑰精浓度为：10.0、20.0、50.0、80.0、100.0ng/mL。4仪器与耗材4.1超高效液相色谱-质谱/质谱联用仪：配备有ACQUITY超高效液相色谱仪，QuattroPremier/XE质谱仪。4.2天平感量0.01g4.3分析天平感量0.00001g4.4冷冻高速离心机（15000r/min）4.5振荡器4.6旋涡混合器4.7组织匀浆机4.8氮吹仪4.9超声波清洗器4.10固相萃取装置4.11OasisWAX固相萃取柱（60mg，3mL；Waters公司）4.12微孔滤膜0.22µm5操作步骤5.1试料的制备取混合均匀后的供试样品，作为供试试料，取混合均匀后的空白样品，作为空白试料。5.2提取称取1.0克试样于50mL离心管中，加入10.0mL提取溶液，超声提取30分钟，10000rpm离心10分钟，上清液转移至另一离心管中；残渣中加入10.0mL提取溶液再次提取，合并两次提取溶液。5.3净化取5.0mL样品提取液，用固相萃取柱平衡溶液稀释定容至50.0mL，过WAX固相萃取柱（3mL甲醇、3mL水、3mL固相萃取柱平衡溶液活化），用2mL淋洗液、2mL水淋洗，5mL洗脱液洗脱，收集洗脱液，氮气吹至近干，用样品稀释液定容至1.0mL，过0.22μm滤膜后超高效液相色谱-串联质谱测定。5.4基质加标工作曲线的制备称取1.0克空白样品基质于50mL离心管中，称取6份，分别加入标准系列溶液100μL，按5.2进行操作，制备基质加标标准工作曲线，碱性橙、酸性橙Ⅱ和酸性金黄浓度为：0、10.0、20.0、50.0、80.0、100.0ng/mL；玫瑰精浓度为：0、0.25、0.5、1.25、2.0、2.5ng/mL。5.5测定5.5.1液相色谱条件a)色谱柱：AcquityUPLCBEHC18(1.7m，2.1mm×50mm)。b)流动相：A相：含0.1%甲酸的5mmol/L乙酸铵水溶液；B相：乙腈。梯度洗脱情况见表1。表1梯度洗脱程序时间（min）流速（ml/min）流动相A流动相B0.00.3901000.310906.00.310906.50.39010100.39010c)进样量：5µL。d)柱温：40℃e)流速：0.3ml/min。5.5.2质谱条件a)离子化方式：碱性橙、碱性玫瑰精，ESI（+）；酸性橙Ⅱ、酸性金黄，ESI（-）。b)扫描方式：多反应监测MRM。c)毛细管电压：3.5KVd)源温度：110℃；e)脱溶剂气温度：450℃；f)脱溶剂气流量700L/h；12种染料的质谱分析优化参数见表2表2工业染料保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量化合物锥孔电压（v）母离子（m/z）子离子（m/z）碰撞能量（ev）碱性橙38212.876.520120.620碱性玫瑰精70433.2399.24035150酸性橙Ⅱ40327.01594079.860酸性金黄50352.01593079.7555.6测定在上述仪器条件下测定基质加标标准溶液及样品溶液。各检测目标化合物以保留时间和特征离子与定量离子所对应的LC-MS/MS色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物保留时间的相对偏差小于20%；样品特征离子的相对丰度与浓度相当混合标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20%～50%10%～20%≤10%允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%5.7空白试验除不加试料外，采