桑黄原生质体融合菌株及其亲本生物学特性的比较研究

中国农学通报2010,26(15):58-61ChineseAgriculturalScienceBulletin0引言桑黄是一种珍贵的药用真菌，隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina)，锈革孔菌科(Hymenochaetacae)，针层孔菌属(Phellinus)[1]。传统中医认为桑黄味甘辛，用基金项目：科技部星火计划项目“药用真菌-桑黄立体栽培及深加工的研发与示范”（2008GA710007）；国家科技部社会公益项目“抗癌真菌——桑黄菌的研究”（2004DIA3J011）。第一作者简介：邱文娜，女，1986年出生，山东济宁人，理学硕士，主要从事药用真菌液体发酵的研究，Tel：[phone]。通讯作者：王秋颖，女，1963年出生，硕士生导师，主要从事药用真菌引种、驯化、遗传育种、栽培、液体深层发酵培养的研究。通信地址：100193北京市海淀区马连洼北路151号药用植物研究所，E-mail：[e-mail]。收稿日期：2009-11-10，修回日期：2010-04-28。桑黄原生质体融合菌株及其亲本生物学特性的比较研究邱文娜1，王秋颖1，曾念开2，王秋雯1，陈磊3（1北京协和医学院，中国医学科学院药用植物研究所，北京100193；2海南医学院药学系，海口571101；3泰州国家医药高新区中医药办公室，泰州225300）摘要：【研究目的】选择和评价桑黄原生质体融合菌株。【方法】应用聚丙烯酰胺垂直平板凝胶电泳技术,对5个供试菌株的酯酶同工酶进行测定，并对供试菌株进行液体培养，测定各菌株的生物量及发酵液中胞外多糖含量、总黄酮含量、酯酶活性及pH。【结果】融合菌株与亲本具有共同的基础条带，同时还产生了自身特异性条带，融合菌株SR002、SR003菌丝生物量是亲本SA04的3倍。SR005菌株合成胞外多糖速率最快，但SR002胞外多糖产量最高，较亲本SA02增加到1.8倍。融合菌株SR005在培养后期发酵液中酯酶活性最高。SR002、SR003两菌株亲缘关系极为相近。【结论】筛选得到的SR002菌株经进一步遗传稳定性验证后可用于以获得生物量、胞外多糖为目的的液体发酵培养。关键词：桑黄；融合子；酯酶同工酶；液体发酵中图分类号：S3文献标志码：A论文编号：2009-2357ComparativeStudyontheBiologicalCharacteristicsofProtoplastFusionStrainsandParentofPhellinusbaumiiQiuWenna1,WangQiuying1,ZengNiankai2,WangQiuwen1,ChenLei3(1PekingUnionMedicalCollege,InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100193;2DepartmentofPharmacy,HainanMedicalCollege,Haikou571101;3TaizhouNationalMedicalHi-techDevelopmentZone,Taizhou225300)Abstract:【OBJECTIVE】Toselecthighbiomass,extrapolysaccharideandtotalflavones-yieldingprotoplastfusionstrainsofphellinusbaumii.【METHODS】Theesteraseisozymeoffivestrainswereexaminedbypolyacrylamideslabgelelectrophoresis.Andtheselectedmetabolicparametersinsubmergedculturesoffivestrainsweredetermined.【RESULTS】Theresultsshownthatthereweretwosteadyidenticalbasicisozymebandsamongstrains,andthethreeselectedprotoplastfusionstrainshadtherepeculiarpatternbands.ThebiomassofstrainSR002andSR003wasthreetimesasstrainSA04,andstrainSR002’sextrapolysaccharidecontenthadincreased1.8foldcomparedwithstrainSA02.StrainSR005hadthehighestphytoesteraseactivity.StrainSR002andSR003’srelationswereverynear.【CONCLUSION】Thethreeselectedprotoplastfusionstrainshaveahighpotentialforproducingextrapolysaccharideandmyceliuminsubmergedcultureafterfurthertestingofgeneticstability.Keywords:Phellinusbaumii;protoplastfusionstrain;esteraseisozyme;submergedculture邱文娜等：桑黄原生质体融合菌株及其亲本生物学特性的比较研究于治疗血崩、血淋、脱肛泻血、带下、闭经、脾虚泄泻等。现代药理学研究表明，桑黄在抗癌、增强免疫力以及抗肝纤维化等方面效果显著[2-3]。有关桑黄中化学成分的研究报道表明，该真菌中含有三萜、多糖和黄酮等活性成分[3]。目前，由于人类过度开采，野生资源十分紧缺，因此人工培养成为提供该菌资源的一种有效方式。在桑黄的人工栽培和液体发酵过程中,存在菌株性状不稳定、不易控制产量和质量的问题，因此选育性状稳定、优质高产的桑黄菌株成为一项重要的工作[4]。该研究对桑黄原生质体融合菌株与亲本的酯酶同工酶酶谱、液体培养各项生理指标进行了比较，以期为选择和评价融合菌株提供依据。1材料与方法1.1实验材料亲本菌株SA02（鉴定为P·baumii）、SA04（鉴定为P·gilvus）；融合菌株SR002、SR003、SR005，保藏于中国医学科学院药用植物研究所真菌室。麦麸-葡萄糖培养基：麦麸50.0g（水煮0.5h，过滤，取滤汁），葡萄糖20.0g，磷酸二氢钾3.0g，硫酸镁1.5g，琼脂15.0g，补水至1000mL，pH自然。基础液体培养基：葡萄糖20.0g，大豆蛋白胨2.0g，磷酸二氢钾0.46g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，补水至1000mL，pH自然。1.2试验方法1.2.1酯酶同工酶分析样品制备：菌丝在麦麸-葡萄糖培养基上培养10天后，刮取菌丝，1g菌丝加4mLTris-HCL（pH6.8）冰浴研磨成匀浆，4℃10000r/min离心10min，取上清液备用[5]；胶的配制及电泳：采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,电极缓冲液为pH8.7的Tris-甘氨酸，浓缩胶3.0%，分离胶7.5%。用醋酸-α-萘酯和坚牢蓝染色液染色，37℃振荡保温15min，待褐色同工酶带显示清楚后清水漂洗，测迁移距离,绘图并照相[6]。1.2.2液体培养各项生理指标测定装有100mL基础液体培养基的500mL三角瓶中，接入5块（直径5mm）活化菌种块，于120r/min，28℃，黑暗振荡培养10天，接种后，每隔48h取样一次，每次3瓶。菌丝体干重的测定：采用干重法测定，用四层纱布过滤菌丝体，蒸馏水洗涤2次，于60℃烘干至恒重，称重。胞外多糖含量的测定：以葡萄糖做标准曲线，测定发酵液中还原糖含量，发酵液经酸解后测定总糖含量，多糖的含量为总糖和还原糖的差值[7]。总糖及还原糖的测定均采用3,5-二硝基水杨酸比色法[8]。总黄酮含量测定：以芦丁做标准曲线，采用紫外比色法测定发酵液中总黄酮含量，发酵3000r/min离心10min，上清液稀释10倍后吸取1mL，加1mL70%乙醇，加入2mL显色液，混匀后在385nm处测吸光度值[9]。酯酶活性测定：因酯酶活性与反应液吸光值变化量成正比,可直接用吸光值来表示发酵液中酯酶的活性[10]，移取0.25mL发酵上清液，加入pH=6.5磷酸缓冲液4.25mL、然后加0.25mL0.006mol/Lα-乙酸萘酯溶液,于40℃恒温水浴定时反应5min，然后加入0.25mL3.0%SDS水溶液终止反应，再加入0.25mL0.02%的固兰B盐溶液显色,混匀计时30s时加入0.25mL1:1的盐酸溶液混匀使显色稳定后，在535nm处测吸光度值。以酶液换成灭菌空培养基其它不变作空白[11]。发酵液pH：用pH计测定发酵液pH。2结果与分析2.1供试菌株间酯酶同工酶酶谱比较分析酯酶同工酶谱如图1所示,5个供试菌株在酶谱类型上表现出差异性，共检测出6条酶带，酶谱带数目一般为3~5条。在Rf=0.44~0.50之间酶带较为集中，共出现3条酶带，其中Rf=0.44、0.48处的两条酶带是各菌株共有的，且着色强度相似，可认为这两条酶带为桑黄菌株菌丝体阶段酯酶同工酶的基础酶带，在Rf=0.54~0.64之间酶带分布较疏，各菌株酶带差异明显，说明该区间是菌株间酯酶同工酶酶带消长较为频繁，最能表达各自特异性的区间。从各菌株酶谱类型可看出，3个融合菌株与亲本相比都有自己的特征性谱带，分别为Rf=0.54、0.64，其中融合菌株SR002、SR003在Rf=0.50、0.60处是两亲本菌株的互补酶带，表现了杂交菌株的典型特征，且两菌株间酶谱差异最小，表明二者的遗传背景相似或亲缘关系较近。2.2供试菌株液体摇瓶培养中各项生理指标的考察在供试菌株的液体摇瓶培养过程中，生物量、发酵液中胞外多糖、总黄酮含量及酯酶活性、pH随着菌丝体的生长不断变化。结果表明，2~6天中融合菌株SR002、SR003生物量变化趋势与亲本SA02相似，融合菌株SR005与亲本SA04相似，在6~10天融合菌株与亲本的生物量产生明显差异，其中SR002、SR003两菌株菌丝干重明显优于亲本，且二者的生长曲线表现出较好的一致性（图2）；供试菌株在培养周期内胞外多糖代谢有明显差异，两亲本在初期多糖合成较快，但后期多糖产量明显低于3个融合菌株，其中SR005菌株较SR002、SR003先达到最高值，但在第10天菌株SR002多糖产量最高。SR002、SR003两菌株的多糖代谢曲线也具有一致性（图3）；发酵液中总黄酮含量测定结果表明，2~6天各菌株黄酮含量均维持在较低的··59中国农学通报个供试菌株液体培养过程中的菌丝体生物量变化（n=3）图35个供试菌株液体培养过程中胞外多糖含量变化（n=3）图45个供试菌株液体培养过程中发酵液总黄酮含量变化（n=3）图55个供试菌株液体培养过程中发酵液酯酶活性变化（n=3）SA02SA04SR002SR003SR005Rf0.440.480.500.540.600.64谱带宽色深谱带宽色较深谱带宽色浅谱带窄色较深谱带窄色较浅··60邱文娜等：桑黄原生质体融合菌株及其亲本生物学特性的比较研究水平，6~10天菌株SR002、SR003、SA02总黄酮含量稍有增加，融合菌株SR005及亲本SA04的总黄酮含量增加明显，其中亲本SA04含量较高（图4）；2~8天各菌株发酵液中酯酶活性比较稳定，8~10天菌株SR005表现出了较强的酯酶活性，其他菌株酯酶活性增加不明显（图5）；各菌株液体培养过程中发酵液pH值均有先降低后升高的趋势，其中SR002、SR003两菌株的pH变化较缓和，变化趋势极为相似（图6）。3讨论与结论该文在实验室对优良亲本菌株SA02、SA04原生质体融合育种的基础上，从同工酶酶谱和液体培养指标两个方面比较研究了亲本与融合子的性状