Aspirin增强溶瘤腺病毒特异性杀伤肝癌细胞的实验研究

1附件1项目编号：浙江省大学生科技创新项目申报书创新项目名称：Aspirin增强溶瘤腺病毒特异性杀伤肝癌细胞的实验研究创新项目负责人：赵红芳学校名称：浙江理工大学申报日期：2013月11日项目类别：个人项目□团队项目√浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划实施办公室制2填写说明一、申报书要按照要求，逐项认真填写，填写内容必须实事求是，表达明确严谨。二、格式要求：申报书中各项内容以Word文档格式填写，表格中的字体为小四号仿宋体，1.5倍行距；表格空间不足的，可以扩展或另附纸张；均用A4纸双面打印，于左侧装订成册。三、申报书由所在学校领导审查、签署意见并加盖公章后，一式1份（均为原件），报送浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划实施办公室。3一、项目简介项目概况项目名称Aspirin增强溶瘤腺病毒特异性杀伤肝癌细胞的实验研究项目性质（）基础研究（√）应用基础研究项目来源（）自主立题（√）教师指导选题起止时间自2013年11月至2014年9月项目状况1、√研发阶段2、中试阶段3、批量（规模）生产（选项打√）申请人姓名赵红芳性别女出生年月1991.3入学年月1997.9所在院系生命科学学院联系电话[phone]电子信箱[e-mail]项目组主要成员姓名年龄性别专业具体分工赵红芳22女生物技术总体负责，实验设计以及细胞培养王彬荣21女生物技术分子实验、细胞培养游承浩20男生物制药细胞实验韦誉20女生物技术整理实验前、中、后期资料项目指导教师姓名王毅刚性别男出生年月1976.12主要研究方向肿瘤的基因治疗近三年获奖成果：国家级__等奖___项，省部级__等奖___项近三年科研经费_______90_____万元，年均____30_______万元4项目主要内容简介癌症仍是威胁人类健康的疾病之一，而肝癌（HCC）在所有癌症中致死率高居世界第二，并且每年的发病率呈上涨趋势。全球每年新发肝癌病例75万，而基于病人的研究显示肝癌的发病率和致死率愈发接近，预示着一旦患上肝癌将很难治愈。随着近些年生物科学的发展，生物治疗有望成为肿瘤治疗的新方法。此次课题将生物治疗（溶瘤腺病毒）和传统的药物治疗结合（Aspirin），以寻求更好的抗肝癌疗效。实验开展将借助新元医药研究所的平台，利用实验室构建的溶瘤腺病毒，通过与Aspirin联用评价抗肝癌的活性。实验将通过摸索确定Aspirin与病毒联合的药物比例以及分析联合用药就单用溶瘤病毒和Aspirin存在的优势。最后分析药物联用增强肝癌杀伤活性的机制。二、项目的研究目的及意义1、申请项目的必要性、目的及意义肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，是我国位居第二的癌症“杀手”，每年大约有10万人死于肝癌。因其恶性度高、病情进展快，病人早期一般没有什么不适，一旦出现症状就诊，往往已属中晚期。故治疗难度大、疗效差，一般发病后生存时间仅为6个月，人称“癌中之王”。肝癌是我们国家肿瘤中的王中王，在全世界肝癌发病的病人当中，我国的肝癌患者占40%以上，将近一半的肝癌发生在中国。因为肝癌跟肝硬化、肝炎有关，我们国家的肝癌患者大部分有肝炎和肝硬化的病史，肝炎在咱们国家是相当多，跟环境、饮食卫生以及血液感染等等有关。肝癌在我们国家发病率应该说是居高不下，对于我们来说如何做肝癌的早期发现、早期诊断、早期治疗是非常有意义的，这就是所谓的“三早”。目前肿瘤的传统治疗手段已经出现了严重的瓶颈效应,靶向基因治疗是一种极具前景并已经取得了良好疗效的癌症治疗手段，而以溶瘤腺病毒为代表的生物治疗成为肿瘤治疗研究的热点。近年来,为了得到更加优化的治疗方案,科研工作者们力图将肿瘤治疗的其它方法与基因治疗法相结合以期达到更佳的抗肿瘤疗效。前人的研究性结果表明溶瘤腺病毒的溶瘤作用与腺病毒进行胞内增殖紧密相关,胞内增殖的前提又要求宿主细胞处于细胞周期中。刘新垣院士等结合基因治疗和病毒治疗的优势提出了一种新型的肿瘤5治疗策略,即癌症的靶向基因)病毒治疗策略,这种策略能达到溶瘤病毒和治疗基因协同杀伤肿瘤的目的,为肿瘤治疗开辟了新的途径。Aspirin由水杨酸二钠盐乙酰化组成，化学名乙酰水杨酸（醋柳酸），是20世纪初由德国化学家FelixHoffman合成并推出的一个化学结构较为简单的“百年老药”。百年来，与其同时代诞生的绝大多数药物在历史长河中渐被淘汰，惟阿斯匹林一枝独秀，因其药理作用不断有新发现，适应不断有新扩展，堪称奇迹。最初，阿司匹林因其解热镇痛和较强的抗炎抗风湿作用而面世；后又发阿司匹林可促进尿酸排泄和抗血小板凝集，使其临床适应证逐渐扩展到预防术后血栓形成、脑血栓成、心肌梗死等。近年来，Aspirin的抗癌作用受到广泛关注，特别是对消化道肿瘤、前列腺癌、乳腺癌的预防或抑制的研究已成热点。并且Aspirin作为临床常用的解热镇痛药,价格低廉,易于购买,不良反应小,为肝癌联合用药提供了新思路。我们小组采用Aspirin与溶瘤腺病毒ZD55单独及联合使用治疗肝肿瘤细胞,通过对比研究来证实具有细胞周期抑制剂的抗肝癌药物在与溶瘤腺病毒联合应用时是否能像人们所期待的那样增强抗肝癌的治疗效果,以期为近来有关溶瘤腺病毒联合抗癌药物的研发提出一些新的启示。62、项目的背景、主要内容、技术水平及应用范围Aspirin作为临床常用的解热镇痛药,价格低廉,易于购买,不良反应小,为肝癌联合用药提供了新思路。溶瘤腺病毒是利用肿瘤细胞与正常细胞结构及代谢途径的差异，靶向性地在肿瘤细胞内复制增殖，最终裂解肿瘤细胞，通过基因工程技术改造腺病毒，使其在肿瘤细胞内复制能力和溶解靶细胞的能力增强，同时这些作用在正常体细胞内被减弱，对正常组织或细胞不会产生毒性作用。本课题联合溶瘤腺病毒与Aspirin作用于肿瘤细胞，研究其治疗的可行性。项目研究的主要实验方法如下：一、细胞形态观察去对数生长期的HepG2细胞，调整细胞浓度，接种于灭菌孔板。设置单独一组溶瘤腺病毒与不同浓度的以及溶瘤腺病毒与不同浓度的阿司匹林共同作用于肝癌细胞。作用24小时后观察细胞贴壁情况、透光性、大小、形态。二、MTT法检测对肝癌细胞的抑制作用不同浓度的Aspirin与溶瘤腺病毒结合，作用于肝癌细胞。取对数长期的细胞，制成每毫升5×103个细胞的悬液，加入培养板中，培养24小时后，吸出液体，加入MTT后继续培养4h，弃上清液，再加入DMSO，于A590下测吸光值，同时做平行实验3组。从而得出癌细胞的抑制率三、荧光显微镜观察将细胞倒置于荧光显微镜下，调节滤光片为绿色激发光，激发出红色荧光，通过显微镜数码相机在明场和暗场下对比细胞与荧光比较视野下荧光的细胞数。将溶瘤腺病毒所带红色荧光蛋白作为参照，通过具有具有荧光的细胞数量来确定不同浓度Asprin与溶瘤腺病毒在杀伤细胞中的作用。本项目基于肿瘤对人类的危害，虽然肿瘤的治疗已经取得了很大的成就，但还需要不懈的努力达到理想的治愈效果。Aspirin与溶瘤腺病毒都有良好的治疗肿瘤的效果，本项目，探究联合药物对肿瘤细胞的杀伤能力，对其可行性进行研究。为联合药物治疗肿瘤提供一定的基础。73、实施该项目所具备的基础、优势和风险申请人所在的团队具有较高的实验技能和从事项目相关工作的经验，熟练掌握与本课题有关的各项实验操作的原理和方法，熟练掌握了生物技术专业知识。而且本团队成员工作严谨，热爱科研，有着一丝不苟的做事态度和较强的应变能力。对于研究过程中所遇到的问题，能灵活的根据自己所学的专业知识来解决问题。申请人所在实验室浙江理工大学新元医学与生物技术研究所基于浙江省重中之重学科平台，拥有美国BD流式细胞仪，ABI7300Real-TimePCR仪，化学发光仪，红外检测仪，酶标仪，Beckman超速离心机，Millipore高效液相色谱仪、纯水仪，日本Olympus荧光显微镜、显微操作仪等国际一流的实验设备，因此具备本课题所需的各项实验条件。本实验室已有以下设备，为该研究的顺利开展提供了坚实的基础：正置荧光显微镜BX51T-32H01型奥林巴斯公司高速冷冻离心机CF16RX日本Hitachi台式低温离心机FRESCO贺利氏二氧化碳培养箱BBG16UV151L型德国Heraeus公司荧光倒置显微镜IX71-22FL/PH日本奥林巴斯稳压稳流电泳仪HE-120天能自动蒸发消毒柜ES-315型Tomy公司梯度PCR仪PTC-200型美国MJResearch紫外分光光度仪HITACHIU2800日本Hitachi水平电泳槽HE-120天能超低温冰箱Nuaire6382ENUAIRE凝胶成像仪GGM/D2GeneGenius生化培养箱LRH-150L上海一恒倒置显微镜XDS-1B重庆光仪纯水系统ZMQS50F01型Millipore公司电子天平BL310型赛多利斯公司空气摇床WSL-100A型BLUDPARDPCR仪PTC-100型-96型美国MJResearch酶标仪TECANDNAexportTECAN8转移仪ELITE200型WELTEC公司液氮罐Director4000ICI脱色摇床Ts－1江苏其林贝尔流式细胞仪FACSAriaTMBD公司以上条件能够充分保证我们顺利进行本课题的研究，为完成课题提供坚实的保障。申请人所在实验室负责人刘新垣院士在肿瘤的靶向基因-病毒治疗方面创造了一系列新思维和新策略，指导教师王毅刚博士在肿瘤的基因治疗方面具有丰富的科研经历和指导经验。团队以溶瘤腺病毒为载体进行的靶向基因-病毒治疗肿瘤方面，完成了许多出色的工作。如增殖性溶瘤腺病毒ZD55-gene系统的建立，并利用其携带外源基因的抗肿瘤研究。以腺病毒和腺相关病毒为载体，通过针对恶性肿瘤的分子靶点如hTERT、AFP及survivin等进行治疗，取得了很好的效果，多篇论文发表在Oncogene,Cancerresearch,Genetherapy,Humangenetherapy,Hepatology,Moleculartherapy,Journalofgenemedicine,Cancerletters等杂志。申请人所在的团队所研究的课题若是研究成功，无疑是给现在的医学提供了更多的治疗肿瘤癌症的方法，也为我们国家乃至全世界的患者带去了康复的福音。但我们也熟知的是，不同浓度的试剂对细胞的效果也大不相同，我们需要设置不同的浓度梯度来进行试验，把最适浓度的范围弄的越来越小，精确度也越来越高，这得投入大量的人力、物力和时间。94、项目计划目标1．验证溶瘤腺病毒ZD55-联合Aspirin可以有效地治疗肝癌。2．找到影响效果最好的浓度范围以及两者的浓度比例。3．进行溶瘤腺病毒ZD55-联合Aspirin能够增强溶瘤腺病毒ZD55-对诱导肝癌细胞凋亡作用机制的研究。4．课题总结，撰写论文并申请工作验收。三、预期成果、知识产权形成及经济、社会效益分析1、项目的预期成果及知识产权归属情况通过该项目的研究，验证溶瘤腺病毒ZD55-联合Aspirin可以有效地治疗肝癌。找到影响效果最好的浓度范围以及两者的浓度比例。并发表核心期刊论文一篇。知识产权归属浙江理工大学和赵红芳等四位同学。102、项目的市场前景分析纯的放、化疗对机体损伤大，副作用强。近年来生物治疗已成为肿瘤治疗的第四种模式，它以其特异性强，副作用小，激发免疫系统，靶基因矫正功能，有望成为未来乳腺癌治疗的主导模式。3、项目的盈利能力分析及财务预算本项目预计需要经费约1万元:a.试验材料费订购化学试剂及试剂盒（5,500）b.实验外协费（1,000）c.会议及调研费（5,00）d.资料印刷费（5,00）e.管理费（1,000）f.人员经费实验技术人员一些劳务费（1,500）4、项目的社会效益分析肿瘤的传统治疗手段已经出现了严重的瓶颈效应，而以溶瘤腺病毒（肿瘤特异性增殖腺病毒）为首的生物治疗成为肿瘤治疗研究的热点。本研究初步实践了肿瘤的靶向基因－病毒个性化治疗策略，构建肝癌特异性杀伤溶瘤腺病毒载体，为临床寻求更为有效的肿瘤靶向基因治疗方案创造条件，为乳腺癌个性化治疗奠定了坚实的基础。并且Aspirin作为临床常用的解热镇痛药,价格低廉、易于购