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植物生物技术的概念：植物生物技术:指对植物品质和性状进行改造的生物技术植物生物技术核心技术及其在农业生产中的应用创造新材料培育新品种开发功能食品快速繁殖稀有材料材料的指纹分析新基因挖掘、定位、辅助育种等第一章•植物组织培养的应用：•（1）快速繁殖和规模化生产•（2）培养无病毒植株•（3）培育转基因植物•（4）突变体筛选•（5）制成人工种子•灭菌的方法和原理•（1）灭菌方法•物理灭菌：高温高压灭菌干热灭菌射线照射灭菌过滤灭菌•化学灭菌：熏蒸灭菌消毒液灭菌•（2）灭菌原理•（a）高温高压灭菌•原理：将待灭菌的物品放在一个密封的高压高温灭菌锅内，在121℃高温和每平方厘米1个大气压下，一般持续15－20min，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子，适于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。•（2）过滤灭菌法•原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于0.45µm微孔滤器装置，使液、气体通过滤膜流入无孔瓶中。•培养基的种类和特点•目前发展出的培养基有几十种，但常用的有MS、B5、white、N6、SH、KM8P等。•（1）MS培养基•1962年Murashige和Skoog为培养烟草组织时设计的，是目前应用最广泛的一种培养基。•无机盐浓度高，养分平衡，尤其是铵盐和硝酸盐的含量很大•它不适合生长缓慢、对无机盐浓度要求比较低的植物，尤其不适合铵盐过高易发生毒害的植物。•与MS培养基基本成分较为接近的还有LS、RM培养基，LS培养基去掉了甘氨酸、盐酸吡哆醇和烟酸；RM培养基把硝酸铵的含量提高到4950mg/L，磷酸二氢钾提高到510mg/L。•（2）White培养基•1943年由White设计的，1963年做了改良。•无机盐浓度较低•适于生根培养•（3）N6培养基•1974年，朱至清等学者为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的•KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼•适于花粉和花药培养。•（4）B5培养基•1968年由Camborh等设计的•含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。铵盐可能对不少培养物的生长有抑制作用•适合于某些双子叶植物特别是木本植物的生长。•（5）SH培养基•1972年由SchenkHid和Hidebrandt设计的。•它的主要特点与B5相似，不用（NH4）2SO4，而改用NH4H2PO4，是无机盐浓度较高的培养基•在不少单子叶和双子叶植物上使用，效果很好。•KM8P•KaoandMichayluk1975•有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，呼吸代谢中的主要有机酸。•主要用于原生质体培养•培养基的成分及配制方法培养基中包括植物生长必需的15种营养元素和某些生理活性物质，可概括为四大类：1、无机营养物:植物生长发育中非常重要镁（Mg）是叶绿素分子的一部分钙（Ca）是细胞壁的组分之一氮（N）是各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成部分此外，铁（Fe）、锌（Zn）和钼（Mo）等是某些酶的组成部分。植物除了碳（C）、氢（H）和氧（O）外，已知还有12种元素对于植物的生长是必需的，它们是氮(N)、磷（P）、钾（K）、硫（S）、钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)、锰（Mn）、铜（Cu）、锌(Zn)、硼（B）和铝（Al）。前6种元素需要的数量较大，称之为大量元素或主要元素后6种元素需要的数量较小，称为微量元素或次要元素按照国际植物生理协会的建议，植物所需要的浓度大于0.5mmol/L的元素为大量元素，小于0.5mmol/L的元素为微量元素2、有机营养成分主要包括碳源（糖类）和维生素类•最常用的碳源是蔗糖和葡萄糖•使用浓度为2%－5%•作为植物生长发育所需的营养物质•调节培养基中的渗透压维生素：硫胺素（维生素B1）一般认为是一种必需的成分吡哆醇（维生素B6），烟酸（维生素B3），泛酸钙（维生素B5）和肌醇也都能显著地改善培养的植物组织生长状况3、植物生长调节物质(激素）主要有五大天然激素（和人工合成的生长调节物质生长素）：植物五大天然激素的合成部位吲哚乙酸分生组织、种子细胞分裂素根尖赤霉素生长的种子脱落酸、乙烯成熟、衰老和环境条件4、其他附加物不是植物生长所必需的，但对细胞生长有益（1）凝固剂•琼脂(agar)是固体培养基的必要成分，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养•琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。（2）抗生素•抗生物质(antibiotic)，包括青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5—20mg/L之间•添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间（3）活性炭•活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用•通常使用浓度为0.5—l0g／L•活性炭（activecarbon）可以降低组织培养物的有害代谢物浓度，对细胞生长有利培养基的制备1、母液的配制配制母液有两个好处:•可减少每次配制称量药品的麻烦•减少极微量药品在每次称量时造成的误差（1）大量元素母液:•可配成10倍母液,用时每配1000ml培养基取100ml母液（2）微量元素母液•因含量低，一般配成100倍甚至1000倍，每配1000ml培养基取10ml或1ml（3）铁盐母液•必须单独配制，若与其它元素混合易造成沉淀（4）有机化合物母液•主要是维生素和氨基酸类物质，这类物质不能配成混合母液，一定要分别配成单独的母液，浓度为每毫升含0.1,1,10mg,使用时根据需要量取（5）激素•每种激素必须单独配成母液，其浓度为0.1,0.5或1.0mg/ml,多数激素难溶于水，2、培养基的配制（1）分别按配方逐个加入各种贮备液，包括生长调节物质和其他的特殊补加物。（2）充分混合之后，用1mol/LNa0H和1mol/LHCl调节培养基的pH。一般来说，植物组织培养适合的pH值为5.8，当pH高于6时，培养基将会变硬，低于5时，琼脂就不能很好地凝固。(3)称出规定数量的蔗糖或葡萄糖，加水直到培养基最终容积。（4）加入一定数量的凝固剂（琼脂或非态胶），加热融化（5）把培养基分装到所选用的培养容器中，每个25×150mm的试管约装培养基15m1；每个100ml三角瓶约装50ml。（6）用封口膜封口（7）灭菌（高压灭菌）对于不能用高压灭菌的药品来讲，经过滤灭菌后的药液等到高压灭菌的培养基冷却到大约60℃时，在超净工作台加入到培养基中，摇匀。第二章看护培养：将发育正常的胚的胚乳作为看护组织，进行胚乳发育障碍胚的离体培养。胚培养的意义1、克服远缘杂交不亲和性和杂种不育性，获得种间或属间杂种2.获得单倍体植株3.克服种子休眠，提早结实4.缩短育种周期，提高育种效率5、种子生活力的快速测定6.稀有植物的繁殖(使种子无生活力或胚发育不全的植物获得后代)离体胚培养时，胚发育几种可能途径（1）胚胎发育途径：幼胚经过心形期，再发育到鱼雷形期，进而进入子叶期，最后萌发成苗。这是幼胚培养成功的途径。（2）早熟萌发途径：幼胚从心形期发育到鱼雷形期后，不经过子叶期直接发育成苗，即跳过某一个发育阶段，这样的幼苗往往很弱小，组织不健全，且难于培养成正常的植株。（3）产生愈伤组织：幼胚培养过程中细胞脱分化产生愈伤组织。通过幼胚培养产生的愈伤组织，经植株再生同样可得到远缘杂种。据报道，由胚培养产生的愈伤组织较其它外植体容易得到再生植株。（4）停止生长或幼胚死亡。非常小的幼胚进行培养时，接种后常遇到细胞生长停滞，如不采取一些拯救措施，幼胚细胞即死亡。第三章愈伤组织：是指将植物上的某个部分切下，形成外植体，接种到适宜的培养基上培养，其外植体组织的增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁组织脱分化：使已分化的体细胞，在人工诱导的条件下回复到未分化的原始状态并具有细胞全能性表达潜力的过程再分化：处于脱分化状态的愈伤组织，再度分化成其他类型的细胞、组织、器官，甚至最终再生成完整植株的过程细胞全能性：所谓细胞的全能性，就是植物的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。差异：（1）受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。体细胞胚胎发生：体细胞胚胎发生：在离体培养条件下，植物体细胞形成胚性细胞，然后经过一系列形态学及生物化学的变化形成类似合子胚结构的过程。愈伤组织诱导的形成过程（三个时期）植物愈伤组织诱导(callusinducing)：使那些已分化的体细胞包括离体的器官、组织和细胞在人工培养基上，经多次细胞分裂而失去原来的分化状态，形成无结构的愈伤组织或细胞团的过程大致经历起动期，分裂期和形成期3个阶段（1）起动期(诱导期)，外植体已分化的活细胞在外源激素的作用下，通过脱分化起动而进入分裂状态,开始形成愈伤组织。(2)分裂期:外植体切口边缘开始膨大，外层细胞通过一分为二的方式进行分裂，从而形成一团具有分生组织状态细胞的过程。(3)形成期:外植体的细胞经过诱导，分裂形成了具有无序结构的愈伤组织时期植株再生的两个途径及其比较（这里不太确定，你们可以看看课件）植株再生的两种途径：器官发生(organogenesis)和体细胞胚胎发生(somaticembryogenesis)体细胞胚胎发生：在离体培养条件下，植物体细胞形成胚性细胞，然后经过一系列形态学及生物化学的变化形成类似合子胚结构的过程。体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着于原组织，每一个体细胞胚称为胚状体，它可以同合子胚一样发育成植株。器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的过程。两种形态发生的结构特点胚状体途径形成的植株细胞内出现方向相反的两极分化，具有根端和芽端两个分生中心不定胚维管组织与外植体维管组织不相连具有典型的胚胎形态发生过程形成的幼苗具有子叶胚状体发育的苗，根和芽齐全器官途径形成的植株单向极性，单个分生中心直接分化为器官不定芽和不定根与愈伤组织的维管相连,无胚胎形态不定芽的苗无子叶先长芽后长根，或先长根后长芽影响器官发生的因素（1）化学因素•早期烟草组织的研究，器官发生的表达可被外源化学物质控制–高浓度的生长素和低浓度的分裂素可以促使细胞连续繁殖——无组织的生长–高浓度的分裂素能引起茎-芽（shoot-bud）形成•auxion/cytokinin之比值的变化成为特定的器官、根或芽分化的一个参数–生长素促进根分化，分裂素促进芽分化–生长素与根形成有关，同时对于愈伤组织的保持也是必须的–在促进芽的分化中，BAP（苄氨基嘌呤）是最有效的（2）物理因素•光：–很多光照条件下，一些植物均能进行器官发生，说明光周期并不是非常重要的因子–有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽，而在连续光照下则不能–尽管如此，多数植物需要一个稳定的光周期，多数培养条件是14-16h光照，8-10h黑暗•温度：不同植物不一样，需要摸索，如烟草和棉花就不一样影响胚状体发生和发育的因素1影响胚状体发生和发育的外部条件①.植物激素a.生长素类物质胡萝卜胚状体的发生可分为两个阶段外植体细胞的脱分化、愈伤组织的诱导、胚性细胞或细胞团的形成，培养基必须含有生长素类物质，主要是2，4-D胚状体的形成和发育，必须在降低2，4-D浓度或完全去除2，4-D的培养基上才能进行其它生长素如IAA、NAA、NOA、2，4，5-T等的作用与2，4-D大致相同，但诱导的效果和对胚状体形成的抑制作用不完全一致绝大多数植物均属于这一模式，但不同的植物在含生长素时胚状体发育时期不一样，有的只能产生胚性愈伤，有的可达圆球胚，有的可达鱼雷胚，个别植物可发育到成熟胚这些不同发育程度的胚状体都必须在转移到无生长素或生长素含量很低的培养基上以后才能继续发育和成株b.细胞分裂素类物质不仅没有诱导的作用(单独使用不能诱导愈伤),而且对已完成诱导的愈伤组织中胚状体的发生还有抑制作用。但在除去，胚状体发生能力还可能部分地恢复。