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安徽医科大学第一附属医院检验科作业指导书文件编号:AYL-S7-320版本:3.0页码:第1页共4页编写者：沈继录审核者：批准人：生效日期：2012.1.1文件发放范围：微生物组文件年度审核审核者：审核者：审核者：审核者：日期：日期：日期：日期：细菌内毒素定量测定一、采血采血前注意：1、护士抽血应选在患者并未接受静点治疗的时刻，否则结果易受干扰（特别是精氨酸及碳酸氢钠等临床抗酸、抗碱及化疗药物对结果影响比较大）2、患者的PH值应在6.8-7.6之间，否则患者本身血液的过酸或过碱会抑制鲎试剂导致检测结果偏低3、准备好除热源真空负压采血管，贴好相应患者姓名、床号、住院号的标签，备好I号处理液（如果工作量较大，也可以在抽血操作的前一天晚上将I号处理液1毫升加入采血管内，放置时间不要超过12小时，可冷藏或室温保存）采血时注意：1、常规无菌消毒2、掰开I号处理液安瓿瓶，用注射器抽取I号处理液1毫升注入除热源采血管内，同一支无菌注射器可以给多个采血管加I号处理液3、在患者尚未进行药物静脉治疗时（如必须接受24小时的抗凝静脉药物治疗，则应选择在非静脉输液一侧肢体），抽取1毫升静脉全血，注入已装有I号处理液的负压采血管（I号处理液与静脉全血体积比应为1：1）中，轻摇混匀即可采血后注意：1、将采血管送至检验科2、如未到统一送血时间，可以将标本放置2至8度之间的冰箱冷藏保存4个小时（若常温保存，建议不超过4个小时）安徽医科大学第一附属医院检验科作业指导书文件编号:AYL-S7-320版本:3.0页码:第2页共4页二、内毒素检测实验操作1、血标本混合液混合15秒钟，1.0ml静脉全血+1.0mlI号处理液混合离心5分钟（3200转/分），制成2倍液a；2、0.6mla中的上清液恒温水浴5分钟（±75度），+0.6mlII号处理液混合（等比稀释），悬混5秒钟后，离心5分钟（4000转/分）,制成4倍液b；3、0.4mlb中的上清液+0.4ml内毒素检测用水混合（等比稀释），漩涡混合器混合3秒钟制成8倍液c；4、用0.1ml内毒素检测用水溶解鲎试剂（用手水平摇晃混匀或漩涡混合器混匀1秒），加入c液体0.2ml（用手水平摇晃混匀或漩涡混合器混匀1秒），上机检测。注意事项：1、在进行第四步操作时，无论加内毒素检测用水还是c液体，避免在鲎试剂安玻瓶内留有气泡（若有则必须用移液器予以吸出再上机检测），否则气泡破裂会引起光路改变影响试验结果。2、实验人员内毒素检测操作良好的标准是：用同一个试管内已经充分混匀的液体进行平行对照检测，以做3个平行管为例，各管所测得的数值不超过其均值的15%；或者质控试验的结果不超过目标值的25%范围。3、数据存储方法：1、如果仪器已经检测出数据则在拔出安瓿瓶后自动保存数据；如果没有检测出数据，即显示结果是小于当时当刻所检测出的值，则在2000s～8400s之间将管拔出,仪器会自动将该数据保存；未将安瓿拔出或过早将安瓿拔出，则该结果将不保存。三、内毒素检测的质控检测方法：定量检测，动态浊度法检测仪器：BET-24A型细菌内毒素分析仪检测试剂：湛江博康海洋生物有限公司生产，内毒素定量专用鲎试剂内毒素标准品：中国生物制品检定所监制并生产的150EU/支内毒素标准品内毒素检测用水：湛江博康海洋生物有限公司生产的同批次内毒素检测用水检测配套物品：无热源试管、无热源吸头安徽医科大学第一附属医院检验科作业指导书文件编号:AYL-S7-320版本:3.0页码:第3页共4页质控流程：150EU/支内毒素标准品1支+1.0ml内毒素检测用水，封口漩混15分钟；→150EU/ml取0.2ml150EU/ml+1.8ml内毒素检测用水，封口漩混30秒；→15EU/ml取0.2ml15EU/ml+1.8ml内毒素检测用水，封口漩混30秒；→1.5EU/ml取0.2ml1.5EU/ml+1.8ml内毒素检测用水，封口漩混30秒；→0.15EU/ml上机检测流程请参照内毒素检测流程质控范围：取0.15EU/ml作为质控点，可以选择各做2个平行对照，国家标准规定为50%-200%；质控频率：每批次鲎试剂做一次质控即可或根据本检验科规定要求自行而定；注意事项：1、在进行第一步内毒素标准品溶解并混悬时要特别注意，安瓿瓶要尽可能靠近顶端开启，以防混悬时液体溅出或与封口膜接触时污染，开瓶时注意用砂轮呈环状磨擦标准品顶端，然后用75%酒精棉擦拭磨痕，用棉球包裹远端并用食指和拇指捏住掰下，完成开瓶；混悬结束后用砂轮摩擦安玻瓶蓝点下方的环凹处，同理掰开，敞开大口便于吸液操作；2、各个步骤混悬时间不能低于规定时间，以保证充分混匀；3、务必保证无菌操作，每次吸标本液体之前注意更换吸头、并吹打新吸头10次（吹打：，即用移液器吸液、打出、吸液、打出反复交替。）；4、每次稀释间隔时间尽可能不要超过30秒，以防内毒素溶液性状改变及活性降低影响结果；5、最后一步上机操作时注意安玻瓶内尽可能不要留有气泡，若有应予吸出；6、标准曲线要选择相应试剂批号的标准曲线，同时注意仪器设置界面中“稀释倍数”要改为“1”倍（质控实验做完之后要将此稀释倍数再重新改为8倍，以免影响以后做血标本结果）安徽医科大学第一附属医院检验科作业指导书文件编号:AYL-S7-320版本:3.0页码:第4页共4页文件更改记录修改后版本更改概述批准人生效日期3.0增加“文件更改记录”2012.1.1