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西昌学院基础生物实验中心一、实验目的本实验是植物生理学课堂教学中的一个重要环节，不仅与课堂讲授的基本理论、基础知识相结合，而且要使学生学会植物生理学的基本实验方法，并在科学态度、实验技能技巧、独立工作能力、理论联系实际能力等方面获得基本的训练。二、基本要求通过教学，要使学生学会植物生理学的基本实验方法、技术和设计思路，掌握植物生理学基本原理的验证方法和定量测定植物体内发生的生理生化变化，并初步具有完成综合性、设计性实验的能力。每次实验结束，学生均需写出一份实验报告。实验1植物组织渗透势的测定【实验原理】当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态,细胞压力势为零时,细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。该溶液的浓度称为等渗浓度。设计并配制一系列具浓度梯度的蔗糖溶液，通过实验找出使细胞发生初始质壁分离的浓度，代入公式计算可得植物组织的渗透势。【仪器与用品】洋葱或紫鸭趾草；显微镜载玻片盖玻片镊子刀片蔗糖移液器【方法与步骤】配制各种浓度的蔗糖溶液→剥取洋葱鳞茎（或紫鸭趾草叶片）表皮→迅速投入各种浓度的蔗糖溶液中→低倍显微镜观察并记录质壁分离的相对程度→确定使细胞发生初始质壁分离的浓度→计算渗透势【思考题】1.测定并计算不同植物组织的渗透势。2.为什么选用有色素的洋葱鳞茎外表皮实验效果较好？【实验原理】根据物理化学溶液理论——拉乌尔冰点下降原理，溶液单位体积中所溶解的溶质颗粒总数相同，则引起冰点下降的数值相同。利用冰点渗透压计测定一定的冰点下降值对应的渗透浓度单位ic，代入公式计算。【仪器与用品】新鲜植物材料；冰点渗透压计、液氮罐、注射器、纱布、吸水纸、Eppendorf管【方法与步骤】取材1-2克新鲜植物材料洗净包在锡箔纸中，放入液氮或低温冰箱中将细胞杀死→取出剪碎放入注射器溶冰，用加压法将胞液挤出，存于Eppendorf管待测→取20微升待测液于冰点渗透压计的测定管测定→提出探头，擦拭后可继续下一个样品的测定。【思考题】冰点下降法与质壁分离法的原理有何不同？实验2植物组织水势的测定（小液流法）【实验原理】把等量的植物组织放入一系列具浓度梯度的蔗糖溶液中，利用小液流法寻找植物组织放入后浓度不变的蔗糖溶液，计算出此蔗糖溶液的渗透势即等于所测植物的水势。【仪器与用品】菠菜试管毛细滴管移液器剪刀镊子蔗糖甲烯蓝【方法与步骤】配制一系列蔗糖溶液→各放入等量植物组织→加入次甲基蓝粉，染色→毛细管移取蓝色小液滴，放入未染色同浓度的蔗糖溶液中→找出液滴不动的蔗糖溶液→计算蔗糖溶液的渗透势＝所测植物组织的水势。【思考题】用小液流法测定植物组织水势与用质壁分离法测定植物细胞渗透势都是以外界溶液的浓度算出的溶质势为根据，它们之间的区别何在？实验3印迹法测定气孔开张度【实验原理】有些有机溶剂涂在叶片表面，失水很快形成一层薄膜，上面就印在叶片表面的保卫细胞与气孔的轮廓。在显微镜下可观察到，结合显微测微尺可测其开张度大小。【仪器与用品】植物叶片显微镜显微测微尺载玻片盖玻片牛皮胶(或火棉胶)【方法与步骤】配制牛皮胶溶液→在叶的下表皮涂胶→成膜后取一小片→镜检→测量【思考题】测量不同生境下、不同植物叶片的气孔开张度，比较后说明原因。实验4植物灰分元素的定性鉴定和定量分析【实验原理】植物风干样品在高温灼烧后，剩下灰分灰分元素发生特定的化学反应后显现出颜色及结晶灰分元素在高温下吸收特定光谱的能量发生能级的跃迁，可用原子吸收分光光度计定量测定【仪器设备及试剂】植物样品高温电炉、显微镜、原子吸收分光光度计、坩埚等，10%硝酸、5%盐酸、5%硫氰化钾等（见实验指导）各元素的标准溶液【实验步骤】植物样品5g放在坩埚（已称重）中，在灰化炉中缓慢升温至400度，灰化1小时，冷却，称重。取出一部分进行灰分元素的定性分析。详见实验指导45页另取一部分称重，放于50ml烧杯中，10%硝酸5ml于电热板上加热熔解，定容于100ml容量瓶中。原子吸收分光光度计测定其Ca、K、Mg、Fe、Zn、Mo含量（同时要测定和元素的标准曲线）观察的现象描述及计算【思考题】灰分元素在植物样品中的含量是怎样的？各灰分元素的化学反应原理是什么？原子吸收分光光度计的工作原理以及他可以测定多种灰分元素的技术关键是什么？实验5植物的无土培养和缺素症状[实验原理]水溶液培养缺乏某种元素会表现出特定的缺素症状[仪器设备及试剂]离子交换器培养罐玻璃房漂浮盘、恒温培养箱、光照培养箱、刻度移液管、通气泵等[实验操作]水培液所需的化学试剂（化学纯）培育玉米苗配制营养储备液配制完全培养液和缺素培养液完全培养液及缺素培养液培养玉米苗观察记载、根据实验结果描述缺素时所表现的典型症状，并分析其原因。[思考题]植物营养必须的大量元素和微量元素有哪些植物的大量元素和微量元素缺乏时的表现症状有什么不同如何做好植物的缺素实验实验6叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定【实验原理】叶绿素是一种双羧酸的酯，可与碱发生皂化作用，产生的盐能溶于水，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素与类胡萝卜素都有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定。叶绿素在光照下可产生暗红色的荧光；叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是叶绿素与蛋白质分离后破坏更快；叶绿素中的镁可被氢离子取代而生成褐色的去镁叶绿素；加入铜盐后，去镁叶绿素则成为绿色的铜代叶绿素，后者很稳定，在光下不易破坏，故用此法制作绿色植物的浸制标本。【仪器与用品】1.仪器大试管或展层缸，台天平，研钵，量筒，烧杯，漏斗，软木塞，滤纸，毛细滴管，剪刀，分液漏斗，移液管，分光计2.试剂丙酮，甲醇，醋酸铜，盐酸，氢氧化钾，石英砂，碳酸钙，无水硫酸钠，四氯化碳，乙醚3.材料新鲜植物叶片【方法与步骤】一、叶绿体色素的提取与分离1.色素的提取2.准备纸条（2cm×20cm，将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm,宽约0.5cm的窄条。）3.点样（注意：一次点样不要太多，风干后多点几次，展层效果会更好。）4.纸层析（结果：最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b。）二、叶绿体色素的理化性质1.叶绿素的荧光现象2.光对叶绿素的破坏作用3.铜代反应4.黄色素与绿色素的分离5.观察色素溶液的吸收光谱【思考题】1.提取叶绿素时为什么要加入少量碳酸钙，加多了会出现什么问题？2.铜在叶绿素中取代镁的作用，有何实用意义？实验7叶绿素a、b含量的测定【实验原理】叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。根据Lambert-Beer定律，如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，换算后得公式：Ca=12.7OD663-2.69OD645（1）Cb=22.9OD645-4.68OD663（2）CT=Ca+Cb=8.02OD663+20.21OD645（3）（3）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。利用上式,既可以计算出叶绿素a和叶绿素b及总叶绿素的浓度（mg/L）。【方法与步骤】色素的提取→测定光密度→计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素a+叶绿素b的浓度→计算每克鲜重叶片中色素的含量【仪器与用品】1.仪器高级分光光度计，台天平，研钵，漏斗，剪刀，移液管2.试剂丙酮，碳酸钙3.材料植物叶片【思考题】1.试比较阴生植物与阳生植物的叶绿素a与叶绿素b的比值有何不同？2.分光光度法和比色法有何不同？3.叶绿素a与叶绿素b在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素a与叶绿素b的定量分析，为什么？实验8植物呼吸强度的测定【实验原理】利用Ba(OH)2溶液吸收呼吸释入的二氧化碳,实验结束后,用草酸滴定残余的Ba(OH)2，从空白和样品两者消耗草酸溶液之差，即可计算出呼吸过程释放的二氧化碳的量。【仪器与用品】广口瓶温度计酸式滴定管干燥管尼龙网制小篮Ba(OH)2麝香草酚酞5%乙醇草酸(重结晶)小麦种子【实验步骤】安排实验装置→放入萌发种子（同时用煮死的种子作对照）于小篮内→滴定→【思考题】比较不同类型种子的呼吸强度。实验9可溶性总糖类的测定实验原理本实验采用葸酮比色法测定可溶性糖的含量。糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与葸酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。在625nm波长下的OD值与糖含量成正比。由于葸酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。该实验方法简便，但没有专一性，绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮试剂反应，产生颜色。仪器与用品1、实验仪器分光光度计，恒温水浴，分析天平，烘箱，刻度试管，漏斗，活性炭，酒精（20%）2、实验试剂酒精（20%），葡萄糖标准液，葸酮试剂3、实验材料各种植物叶片、种子、果实方法与步骤1、可溶性糖的提取干材料50mg→10ml刻度离心管（4ml80%酒精）→水浴40min→离心→上清液+10mg活性炭→脱色（80℃）30min→定容至10ml→过滤→滤液2、显色及比色滤液1ml+5ml葸酮→沸水浴10min→冷却→OD值（625nm）3、绘制标准曲线思考题1、应用葸酮法测得的糖包括那些类型？2、你知道还有哪些方法可以测定糖类？实验10吲哚乙酸氧化酶活性的测定实验原理吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体吲哚乙酸的水平，起着重要作用，而影响植物的生长。酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。仪器与用品1、实验仪器72型分光光度计，离心机，恒温水浴锅，天平，研钵，试管，移液管，烧杯2、实验试剂磷酸缓冲液，2，4-二氯酚，氯化锰，吲哚乙酸，吲哚乙酸试剂。3、实验材料豆类种子方法与步骤1、豆类种子30℃温箱萌发3-4天，选取生长一致的幼苗，留下胚轴作材料。2、20株胚轴称重→加磷酸缓冲液5ml+石英砂→研磨→加提取液→离心20min粗酶液。3、试管1+氯化锰+二氯酚+IAA+酶液+磷酸缓冲液→30℃水浴30min试管2+氯化锰+二氯酚+IAA+磷酸缓冲液4、反应液2ml+4ml吲哚乙酸试剂→30℃暗处保温30min→显色5、将反应液于530nm处测定光密度值6、根据读数查出相应的吲哚乙酸残留量7、配制从0-35μg/ml的IAA浓度，分别测定OD值，绘制标准曲线。8、计算酶活力U=(C2－C1)×10/1/V’×V×t/60简化成：U=(C2－C1)×200思考题1、试比较幼苗的胚轴和胚根中吲哚乙酸氧化酶活性大小。2、试比较幼根的根尖和延伸区中吲哚乙酸氧化酶活性大小。实验11植物组织中总氮、蛋白质氮含量的测定（微量凯氏法）【实验原理】植物组织中的有机氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺，以及少量无机氮化物，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。将植物材料与浓硫酸共热，硫酸分解为二氧化硫、水和原子态氧，并将有机物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮转变成氨，并进一步生成硫酸铵。为了加速有机物质的分解，在消化时通常加入多种催化剂，如硫酸铜、硫酸钾和硒粉等。消化完成后，加入过量NaOH，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3导入过量的硼酸溶液中，再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算，可得出含氮量。蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量，（约在14％～18％，平均约含氮16％）所以，可用蛋白氮的量乘以6.25（100／16＝6.25），算出蛋白质的含量。【材料、仪器设备及试剂】材料：各种干燥、过筛（60～80目）的植物样品仪器设备：1.消化管；2.微量凯氏定