BD流式分选的原理和应用.

流式细胞术基本原理及应用申晓萌Tel:15801676058E-mail:[e-mail]流式细胞仪的原理流式细胞仪的应用BDFACSJazz个人型流式细胞分选仪纲要BD公司简介FairleghS.DickinsonMaxwellW.Becton美国BD公司是由MaxwellW.Becton和FairleighS.Dickinson于1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。全球500强企业之一1974年，BD与美国斯坦福大学合作研制出全球第一台商用流式细胞分选仪，不断推陈出新，在流式细胞领域始终保持领先地位。市场情况BD是全球最大的流式细胞仪生产商和供应商，在全球的占有率为85%，高端分选型流式细胞仪占有率大于90%。在全国各大医院和科研院所，大部分为BD公司的仪器，总计数量已超过2000台，如：清华大学，北京大学，中科院系统，军科院系统，医科院系统等等BD公司流式细胞仪FACSJazzLSRFortessaFACSCantoIIAccuriC6FACSAriaIIInflux流式细胞仪特点及检测标本•特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析；•可检测的样本种类多样–(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞–(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液检测范围细胞结构组成细胞功能大小细胞表面、胞浆、核特异性抗原粒度细胞活性DNA、RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子、pH值、膜电位酶活性8流式细胞仪能告诉我们什么？•细胞的相对大小（前向角散射光信号，FSC）•细胞的相对颗粒性及内部结构的复杂性（侧向散射光信号，SSC）•相关的荧光强度前向角散射光信号FSC侧向角散射光信号SSC流式细胞仪的检测信号-荧光激发光谱（Excitation，Ex）：是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max发射光谱（Emission，Em）：是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光发射波峰（最大发射波长）：Em-Max488nm520nm异硫氰酸荧光素（FITC）荧光素分子利用激发光提供的能量激发荧光分子的初级电子跃迁到激发态，然后返回基态轨道释放能量（也就是发射光）。12流式细胞仪的检测信号-荧光使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量常用的荧光素：PE，FITC，APC等13流式对照的设置对照的设置流式细胞术显示的荧光强度是相对的、可调节的，所以需要设置一系列对照来确定细胞是否阳性。阴性对照阳性对照单染对照（补偿对照）15对照的设置-阴性对照空白对照：即不进行任何标记的细胞。主要用于确定待测标本的自发荧光同型对照：即用同型抗体作平行实验。同型抗体为没有特异性、与荧光抗体亚型一致的免疫球蛋白（即Fc段相同，Fab段不同）。用于确认细胞是否为抗原特异性染色，排除非特异染色。16对照的设置-阳性对照阳性对照即应用已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）进行平行实验。通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性。与阴性对照一起判断测试样品是否为特异性染色。17对照的设置-单染对照（补偿对照）补偿对照-多色荧光分析会有光谱交叉，需要荧光补偿几色分析需要设置几个补偿对照18单染对照（补偿对照）-荧光补偿方法530/400580/30FITCPE19流式细胞仪如何得到细胞20分选细胞从复杂的细胞群体中得到高纯度的靶细胞，进一步深入研究高速分选原理21分选时，液流自驱动力的作用下断成高度均一的液滴。在喷嘴下的几毫米处，液滴从液流断开。从颗粒被检测到液滴断开的时间称为液滴延迟时间，由BD专利的Accudrop技术直接计算符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴将要从液流断开时，液流被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液滴通过被充电的偏转板。受静电吸引或排斥，带电液滴将向左或向右偏转。不带电的液滴不偏转而流入废液槽。22部分应用实例科学是复杂的，工具是简单的转染绿色荧光蛋白GFP细胞的分选23用带GFP(绿色荧光蛋白)标记的质粒转染细胞，在488nm激光激发下，表达GFP的细胞发绿色荧光。本实验为U937细胞转染GFP和目的基因，用BDFACSAriaIII分选高表达GFP目的基因的细胞。本案例用BDFACSAriaIII分选GFP阳性细胞，该样本GFP阳性的目标细胞含量仅为1.9%，分选后回测，目的细胞纯度高达99%。转染绿色荧光蛋白GFP细胞的分选24分选后细胞在显微镜白光视野下可见，细胞膜清晰，状态很好，在荧光显微镜下GFP所发绿光清晰可见，充分说明FACSAriaIII分选低表达细胞的高纯度和高活性。DNA含量检测•常用DNA染料：Hoechst33342、Hoechst33258、DAPI、色霉素A3（CA3）、吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI）、7-AAD、DRAQ5、EB等。结合位点不同染色方法不同激发波长不同PI在DNA检测中应用最广泛DNA染色过程中一定不要洗涤25DNA含量检测•细胞周期•细胞凋亡•染色体分选•肿瘤干细胞分选26细胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量细胞数量2N4NDNA含量检测27•细胞周期小鼠精原细胞倍性分析分选28本实验取小鼠睾丸细胞，用Hochest33342进行染色，BDFACSAriaSORP倍性分析后分选其中的初级精母细胞（4N），分选出的初级精母细胞后续用来抽提RNA。小鼠精原细胞倍性分析分选29小鼠睾丸细胞倍性分析，可清楚看到各倍体细胞群：N、2N、4N。本案例用BDFACSAriaSORP的UV激光光进行Hochest33342染色的小鼠睾丸精原细胞倍体分析分选，从单参数直方图可见，单倍体（N）峰、二倍体（2N）峰、四倍体（4N）峰区分很开，说明本实验检测精度高，CV值低。肿瘤细胞的非整倍体分析二倍体异倍体四倍体正常细胞DNA量相同，癌变细胞的DNA指数发生变化，非整倍体出现概率很高。用流式DNA峰图鉴别细胞的倍体在病理学上是一种快速、直接的检测方法。30植物倍体的分析植物细胞的倍体非常复杂，常以多倍体形式存在。检测时多采用对数形式。植物的倍性鉴定是多倍体研究的重要内容之一。流式细胞术已应用于玉米、向日葵、甘薯、木薯、猕猴桃、葡萄、棉花和李子的倍性鉴定。这将有利于果树和农作物的培植和育种。31细胞凋亡凋亡后期，细胞膜通透性增大，DNA降解，降解产生的DNA核小体片段从细胞中释放，因此，凋亡细胞比活细胞含有更少的DNA。凋亡细胞的DNA峰会出现在正常细胞G0/G1峰之前，称为sub-G1峰。Sub-G1峰的出现被认为是凋亡细胞的标志之一。32肿瘤细胞凋亡检测33方法：Jurkat细胞分别用DMSO（对照；2%）或HU-331（一种诱导细胞凋亡的大麻素；CaymanChemicalCompany）处理6小时。然后用AccuriCellCyclePhaseDeterminationKit(KR-300)固定细胞并染色。细胞凋亡-AnnexinⅤ/PI双标记法细胞凋亡时会发生一系列形态学改变。质膜内侧的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）重新分布，由胞膜内侧翻转到胞膜外侧，可以通过膜联蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）来检测。为了区分凋亡和坏死两种不同情况下的PS外翻，AnnexinⅤ常与鉴定细胞死活的染料（PI或7-AAD）联合使用。细胞凋亡的PS与AnnexinⅤ结合，呈AnnexinⅤ阳性，同时凋亡细胞的细胞膜是完整的，PI不能进入，因此，凋亡细胞是AnnexinⅤ+/PI-。死细胞的PS与AnnexinⅤ结合也呈阳性，但死细胞的膜已经破裂，PI能够进入，所以死细胞是AnnexinⅤ+/PI+。34FITCAnnexinV/PI染色和流式细胞仪分析。Jurkat细胞（人T细胞白血病）用6µM的喜树碱或0.1%DMSO（阴性对照）4小时，引导凋亡。细胞根据AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒的染色指南，用FITCAnnexinV和碘化丙啶（PI）染色。与DMSO对照组相比，喜树碱处理会增加细胞的早期凋亡（PI阴性，AnnexinV阳性），即图中绿色部分。死细胞（PI阳性，红色部分）和活细胞（AnnexinV和PI阴性，黑色部分）群体很容易辨别。图中的数据来自BDAccuriC6流式细胞的BDCFlow®Plus。35细胞凋亡-AnnexinⅤ/PI双标记法染色体分选36肿瘤干细胞分选37肿瘤细胞株的SP细胞。人HT-29结肠癌细胞使用Hoechst33342染色，装有375nm激光器的BDFACSAriaⅢ上采集数据（左侧散点图）。作为对照样品，SP表达被抑制（右侧散点图。）BDFACSJazz个人型流式细胞分选仪可靠的性能，小巧的机身，实惠的价格开启了细胞分选的新时代三激光8参数检测个人分选精彩演绎BDFACSJazz配置及核心技术指标（1）39光学系统原厂预优化设置和直观的操作最高可达三激光6色，488nm激光器标配，405nm、561nm、640nm激光器选配支持多种荧光染料简化的光路调节针孔摄像视频窗口检测灵敏度：FITC125MESF；PE125MESF40液流系统声学耦合喷嘴装置新型液流控制台和分选软件喷嘴装置：喷嘴使用螺口与系统耦合，取下喷嘴清理时不会影响光路系统的校准主要参数：最小检测大小：1um最小上样体积：200ul分辨率：3%CV数据获取速率：最高200,000事件/秒可更换液流管路BDFACSJazz配置及核心技术指标（2）41分选参数：专利的BDFACSAccudrop技术可拆卸偏转电极板收集方式支持克隆及单细胞分析等多种应用分选仓内情况清晰可见BDFACSJazz配置及核心技术指标（3）42软件系统：更好的操控性能直观的工作流程强大的数据分析索引分选让克隆研究更加高效BDFACSJazz配置及核心技术指标（4）43保护设施：Baker定制生物安全柜，符合严格的国际行业标准同时保护样本、操作者和实验室环境完全符合生物安全标准有效的气流控制BDFACSJazz配置及核心技术指标（5）定期维护保养经验丰富的技术人员定期的用户交流会议各种形式及内容的小型专业讲座实际操作上机培训在线技术交流!更多的产品信息请登陆：