Biotechnology

RFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphismRFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。RFLP能对植物的抗性基因进行定位和分离，利用RFLP技术，对于核基因组或叶绿体基因组、尤其是后者，若能提取纯净DNA，则可直接从酶切后的电泳图谱看出其多态性，利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种在污染环境下抗性分化进化水平上的差异。RFLP技术在用于基因型分型研究的同时，同样的可用于在不同环境中微生物多样性的研究。RFLP技术主要包括以下基本步骤:DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段(Southern杂交)和结果分析。优缺点RFLP遍布低拷贝编码序列，并且非常稳定，但RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模的分子育种，在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。与核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中许多非常繁琐工序，但相对RAPD而言，RFLP方法更费时、费力，需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，仅对基因组单拷贝序列进行鉴定。但RFLP又有比RAPD优越之处，它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、还是由缺失、插入造成的。基本类型点的多态性折叠表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。Southern杂交即可诊断。序列多态性折叠因DNA链内发生较大部分的缺失、重复、插入等变异，其结果是即使其内切酶位点碱基序列没有变化，但原有的内切酶位点相对位置发生变化从而导致RFLP。RAPD:randomamplifiedpolymorphicDNARAPD是建立在PCR(PolymeraseChainReaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。RAPD即随机扩增多态性DNA标记，其基本原理与PCR技术一致。基本概述运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增。聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。相关原理RAPD是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这样的一个推理：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。主要特点RAPD的优势。①无需专门设计RAPD扩增反应引物，也无须预先知道被研究生物基因组的核苷酸序列，引物可随机合成和随机选定，长度一般为9-10个核苷酸；②每个RAPD反应中，仅加单个引物，就可通过引物和模板DNA随机配对实现扩增，扩增无特异性；③退火温度低，一般为36℃，这样的温度能保证核苷酸引物与模板的稳定结合，同时允许适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，使RAPD有较高的检出率；④RAPD技术简便易行、省时省力，不需要RFLP分析的预备性工作：如克隆的制备、同位素标记、Southern印记反应及分子杂交。RAPD易于程序化，利用一套随机引物可得到大量的分子标记，并可借助于计算机系统进行分析；⑤RAPD分析所需的DNA样品量极少，这对于生物早期取样鉴定或在DNA受限制的情况下是十分有利的。解决方法（1）扩增偏差或无扩增。―在部分或全部管中缺少一个组分。―PCR抑制物可能与DNA一起纯化，改变DNA的浓度。―在DNA分离中加入一个清洗步骤（如苯酚抽提）。―稀释新的DNA溶液。―引物母液失效。重新配制母液，使用不同的引物或提高引物浓度。―延长退火时间（在PCR程序中的第二部分），或降低升温转换步骤之间的速率。―提高每个反应中的Taq聚合酶的浓度。―补加新的组分，该灭菌的都高压灭菌。（2）扩增结果差，条带模糊或难以辨认。―更换Taq聚合酶缓冲液。―检查引物（使用另外一个引物，或者将引物末端标记，在16%6mol/L尿素聚丙烯酰胺胶上电泳检测）。―检查Taq聚合酶活性（与不同批量的酶作比较）。―改变DNA浓度。（3）高相对分子质量产物弥散状分布4kb。―降低DNA浓度。―降低Taq聚合酶浓度。―减少凝胶上样量。―可能是由于循环数过多的结果，减少循环数。―确认是否使用正确的缓冲液制备凝胶。―在较低的电压下电泳。（4）在对照和所有检测样品中均为一条很强的单一带。―确认引物序列不是回文结构。这可能是引物多聚体造成的结果。使用不同的引物。（5）带谱不可重复。―DNA过多或过少。把基因组DNA浓度控制在10～100ng范围之内，DNA量太少时，“真正”靶序列与引物的结合效率低，因此引物扩增会产生假的条带，这就称为引物伪迹；DNA量太多会导致错误配对（指引物与基因组DNA的配对）。每个样品进行两个不同DNA浓度的反应。―只考虑主要条带。（6）染色后凝胶背景太强影响分辨率。―减少染色时间。―凝胶脱色时间延长。―PCR反应中DNA含量或Taq聚合酶过多。（7）低相对分子质量产物分离不充分。―在更高浓度的琼脂糖凝胶、专业纯凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上分离产物。技术问题1温度RAPD一般反应条件是：变性92－95℃，常用94℃，30－60s；退火35－37℃，30－60s；延伸72℃，60－120s。变性和延伸温度一般没有太大变化，而退火温度影响较大。退火温度低，引物和模板结合特异性较差，出现的条带可能增多；退火温度高，引物和模板结合特异性增加。有人提出，在寻找基因差异为目的的实验中，退火采用33－34℃效果更好。在优化方案中，退火温度可能要提高，以便降低背景，得到少而清晰的＂带＂。温度的梯度率也是十分重要的，特别是退火与延伸之间的梯度尤为重要。各种仪器的控温、升降温性能均有差别，一些仪器（如一些旧型号的仪器）在到达特定的温度前就开始计时，一些PCR仪显示的温度与实际温度会有差异。这些在设计程序和结果分析时有必要考虑，所以注明所用仪器的生产厂家、品牌、规格，就显得很有必要，对于同一批实验，注意控制在同样的温度条件下进行反应，结果才有可比性。2反应物的影响PCR扩增受多种成分的制约，产物仅在部分循环中呈指数式增长，逐渐将达到一个平台期，模板是关键制约因素之一，RAPD产物取决于此，实验中非常精确的模板浓度是十分关键的一个步骤。浓度过低，分子碰撞机率低，偶然性大，扩增产物不稳定；浓度过高，会增加非专一性扩增产物。更重要的是，若循环数控制不好，引物过早消耗完，后面循环中，PCR扩增产物的3端会和原模板及每一次循环的扩增产物退火，造成不等长度的延伸。因此，如果原模板浓度过高，非专一性扩增产物就足以形成背景，这是高浓度模板造成弥散型产物的原因。相对而言，模板纯度影响不大，即反应液中蛋白质、多糖、RNA等大分子物质影响不大。理想的模板和引物浓度能产生多态性丰富、强弱带分明的RAPD图谱。引物3端的重要性似乎更大。此外，Mg＋2浓度也影响反应的参数包括产物的特异性和引物二聚体的形成，人们在各自的实验中得出不同的结论，大约在1.5－4mmol/L范围内。总之，各种反应物的浓度应事先进行筛选优化。3污染问题实验中应设空白对照，因为引物、各种缓冲液和双蒸水都会造成污染。而且Taq酶也可能出现污染，给分析带来困难，所以必须设置对照以排除系统误差。并且，酶也尽可能优化。4扩增条带的取舍为了克服RAPD重复性差的问题，应设置重复实验。作为DNA多态性标记位点的条带是应该可重复的，重复性好是最重要的取舍指标，而带的强弱不应该作为取舍的指标。有学者认为带的强弱与其在基因组中的拷贝数有关。但据Thormann对十字花科植物分析，RAPD产物的强弱与该产物在基因组中的拷贝数无直接关系，而与引物及模板的同源性程度有关。分析一个位点时，要作全面分析，若某一个体的全部带均弱，其模板可能有问题（浓度、分子量）；若某一个体的大部分带与其它个体强度一致，仅有一条或少数几条带弱，可能存在拷贝数差异。重复性不好的弱带（无规律出现的带）可能由非专一性扩增、产物间退火或其它人为因素造成，不能记录。异源双链问题Ayliffe研究亚麻锈病菌时发现F1代中出现的一条带在亲本中没有出现，进一步研究发现这一条带是由2个等位基因组成的异源双链形成的，这2个等位基因除中间插入的38bp的序列外，其余序列相同。这种条带可以在后代中遗传，在该研究中这种条带大约占0.16％。在蜜蜂的研究中也发现了相似的问题，这种条带可以用单链核酸酶将其消除。也可以将电泳温度提高到60℃以上，使异源双链变性，以消除其影响。非孟德尔遗传的条带Heun等分析认为，在显示多态性的非模糊条带中有92.5％的表现为孟德尔显性遗传，其余的条带不符合孟德尔遗传，分析认为可能由不同的序列组成。一般实验中大多采用符合孟德尔遗传的条带进行分析。在连锁图谱分析中，基因型错误可以部分消除，即在F1代或1：1混合物中没有出现的条带，在其父母本中应尽可能去掉。5电泳分辨率问题电泳时，基因组不同位置的扩增产物共同移动的可能性是有的，即不同分子量的扩增产物可能在电泳时没有分开而形成一条带，凝胶分离系统和基因组的亲缘关系有可能提高这种概率。一般而言，聚丙烯酰胺和银染的分辨效果比琼脂糖和溴化乙铵要高，用较长(可达到20cm)或浓度更高(2%)的琼脂糖凝胶有助于提高分辨率。当然，随着分辨率和灵敏度的提高，更可能出现实验误差。所以有人评述：最保险而简单的方法是用琼脂糖电脉分离而且只注意那些无疑而重发性高的带。但是，聚丙烯酰胺和银染所揭示的高信息量的多态性无疑可加快分子标记的鉴定过程。6显性标记问题RAPD标记来自于模板DNA的复制，经过30一40次循环，扩增条带数量理论上可达2。原模板中扩增位点是纯合还是杂合已无法判断，因为纯合位点的扩增条带只相当于杂合位点的2倍，电泳时无法检测到其差别。杂交中。如果亲本一方为纯合体，F1代就可以全部表现出该条带；如为杂合体，该条带在F1中应为l：l分离，即一半后代有该条带，而另一半则没有。当然来自于多拷贝区的条带分析更为复杂图位克隆程序1、建立目的基因的遗传分离群体2、找到与目的基因紧密连锁的分子标记3、用遗传图或物理作图将目的基因定位在染色体特定位置4、构建含有大插入片段的基因组文库5、以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库6.用阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群7、通过染色体步移、登陆或跳查，获得含有目标基因的大片段克隆8、通过亚克隆获得