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AFLP实验操作指南一、实验操作流程1．提取DNA样本2．DNA酶切、连接同时进行（1）反应体系（50ul）成分体积（ul）双蒸水35.810*Tangobuffer5EcoRI(10u/ul)0.5MseⅠ(10u/ul)0.5Ea（5pmol/ul）1Ma（50pmol/ul）110mMATP1T4DNA连接酶（5U/ul）0.2模板DNA（100ng/ul）5总体积50（2）反映程序37℃反应3~5个小时，最后保存于4℃。（3）检测取4－6ul酶切液进行酶切效果检测，跑出的带以弥散状、无明显主带为好。（4）稀释按1：10的比例稀释，已稀释的和未稀释的均可长时间储存于-20oC备用。3．预扩增（1）反应体系成分体积（ul）双蒸水4.4Premixtaq10EA00(100ng/ul)0.3MC00(100ng/ul)0.3稀释后已连接DNA模板5总体积20（2）反映程序a、94℃2minb、94℃30s、56℃30s、72℃1min共24个循环c、72℃5mind、保存于4℃（3）检测取未稀释的预扩增液4－6ul进行琼脂糖电泳检测。（4）稀释取部分预扩增后溶液按1：25的比例稀释。将已稀释的和未稀释的保存于－20℃储存。4.选择扩增（4）反应体系成分体积（ul）双蒸水4Premixtaq10EA--(100ng/ul)*0.5MC--(100ng/ul)*0.5稀释后已连接DNA模板5总体积20*:EA--,MC—后面两个碱基因不同引物对而不同。迅速漩涡混匀10s，或者离心4000r/min，10s。（2）反应程序a、94℃4minb、第1～13个循环：94℃30s,65℃30s,72℃1min（退火温度每隔一个循环降低0.7℃）；c、第14～36个循环：94℃30s,56℃30s,72℃1min；d、72℃5min,4℃保存。6．变性（1）变性剂（Loadingbuffer）配方组分体积98%去离子甲酰胺49mlEDTA(0.5MPH=8.0)1ml二甲苯青FF(XyleneCyanoleFF)0.125g溴酚蓝（BromphenolBlue）0.125g（2）变性：将7ul变性剂加入14ulPCR反应产物，95℃变性5min，并迅速置于冰上。7.制胶溶液（1）一块胶的配方（60ml）将12ml5XTBE和25.2g尿素（Urea）混合加水定容至51ml，向其中加入9ml40％的丙烯酰胺溶液，240ul10%过硫酸胺（APS）和60ul四甲基乙二胺（TEMED）。（2）各组分配方5XTBE：54gTris碱(Tris-base）,27.5g硼酸(B-acid）和3.72gEDTA(或0.5M,PH=8.0，EDTA20ml)混合定容至1L。40％丙烯酰胺溶液：2g甲叉双丙烯酰胺（N、N-MethyleneBisacrylamide）,38g丙烯酰胺（Acrylamide）混合加水定容至100ml，4℃棕色瓶可保存2个月。10％过硫酸胺溶液：1g过硫酸胺（APS）加ddH2O定容至10ml。8.亲水和疏水处理及灌胶（1）长玻璃（亲水玻璃）处理：a、亲水剂制备：3ml无水乙醇，10ul亲水硅烷,10ul冰醋酸混合。此为一块板用量。b、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好。c、用手巾纸浸亲水剂涂搽玻璃板。d、干燥20分钟，用约2ml95％的酒精再轻轻涂搽玻璃板（以均一方向）然后在垂直向再涂搽一遍。e、晾干约十分钟。（2）短玻璃（疏水玻璃）处理a、换手套，以防亲水剂和疏水剂交叉污染。如果出现污染情况，可将玻璃浸入10％的NaOH溶液中。b、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好。c、用纸巾浸750ul剥离硅胶分两次涂搽玻璃板，要均匀。d、干燥20分钟，用约2ml95％的酒精再轻轻涂搽玻璃板（以均一方向）然后在垂直向再涂搽一遍。e、晾干约十分钟。f、疏水处理做一次大约可以跑5块胶再做或当出现轻微扯胶情况时再做。（3）将长玻璃放在水平泡沫垫上，亲水面向上，将两个胶条平行分置于其较长的两边，然后轻轻放上疏水玻璃，疏水面向下。这样在两玻璃间形成了一个矩形空隙。用夹子夹住固定。（4）用胶带将左右两边和底边封上，留出插梳子的边（有凹边的那一边），封时要均匀不留气泡。（5）将梳子插入有凹边的缝隙，看是否容易均匀，不行要适当调整。（6）将有凹边的那边稍稍垫高，然后配胶用注射器筒灌入，要从一边均匀灌入，胶中不留气泡。（7）将梳子平直边插入凹口缝隙，以形成一个胶的平直端。注意其端线应与玻璃板的长边垂直。（8）让胶至少聚合两个小时。9.电泳（1）将电泳槽底盒装入400ml1XTBE缓冲液，上盒装入500ml1XTBE缓冲液。（2）轻轻拔掉梳子，固定玻璃于电泳仪上，到入上盒缓冲液，用1000ul枪冲洗凹口缝隙，冲干净为好，65W预电泳30min。（3）预电泳完毕断开电源，再次冲洗缝隙，然后将梳子齿端插入凹口缝隙，其齿尖端轻轻的插进胶中，以构成点样孔。（4）点入3～5ul变性后的样品。（5）65W电泳约90min，直到溴酚蓝到离顶端1/2为好。（或二甲苯青刚到底部）（6）电泳完毕，分开两玻璃板，将固着胶的亲水板放入预先准备好的10％的醋酸固定液中浸泡固定脱色。10.银染（一）试剂的配制1.固定/终止溶液（10%的冰醋酸）：将200ml冰醋酸加入到1800mlddH2O中，现用现配，不能反复使用。20min2.染色液：2L超纯水中加入2g硝酸银。3.反应液：2L超纯水中加入30gNaOH、10ml甲醛，冰浴中冷却至10℃。（二）染色步骤1.将长、短玻璃板分开：电泳结束后，用一个塑料棒小心地将长短板分开，聚丙烯酰胺应粘附在短玻璃板上。2.固定胶：将粘着聚丙烯酰胺凝胶的短玻璃板放入塑料浅盘中，加入固定终止液，使粘着胶的玻璃板浸泡在固定/终止液中。将胶在摇床上摇动20min或至电泳示踪染料消失。胶可在固定/终止液中过夜，收集固定终止液，以备下面步骤8中终止染色反应用。若此时反应液尚未冷却，可放入冰浴中致冷。3.洗胶：在摇床上用超纯水洗胶3次，每次2min，或3min，2次。每次洗完后将粘着胶的玻璃板取出沥干10~20s再进行下一次洗涤。4.染色：将粘着胶的玻璃板移至染色液中，在摇床上摇动30min。将胶从染色液中取出，放在一边。染色液回放到烧杯中，塑料盘清洗后加入超纯水。这段时间不要超过5~10s。漂洗时间过长会导致信号变弱。5.洗胶：将胶浸入超纯水中，取出沥水，立即放入盛有预冷反应液的塑料盘中。胶从超纯水中取出到放入反应液的时间不能超过5~10s。6.显色反应：胶在摇床上摇动至出现模板带或可见一条带。将胶转至剩余的1L预冷的反应液中，继续显色10min或更久直至全部条带显现出来。7.终止显色反应：往反应液中加入1L固定/终止液，在摇床上反应2~3min，终止显色反应。时间过长会使条带褪色。8.洗胶：用超纯水漂洗聚丙烯酰胺凝胶2次，每次2min。9.干胶、观察：通过热对流或室温放置，使胶变干。在白光灯下，也可置于白色或黄色背景下观察，用单反相机拍照。附表：接头和引物序列编码接头和引物序列Ead55-CTCGTAGACTGCGTACCEad35-AATTGGTACGCAGTCTACMad55-GACGATGAGTCCTGAGMad35-TACTCAGGACTCATEA005-GTAGACTGCGTACCAATTCA-3MC005-GACGATGAGTCCTGAGTAAC-3EA015-GACTGCGTACCAATTCATC-3EA025-GACTGCGTACCAATTCAGA-3EA035-GACTGCGTACCAATTCACG-3EA045-GACTGCGTACCAATTCATG-3EA055-GACTGCGTACCAATTCAAG-3EA065-GACTGCGTACCAATTCAAC-3E015-GACTGCGTACCAATTCAGC-3E025-GACTGCGTACCAATTCACC-3E035-GACTGCGTACCAATTCACA-3E045-GACTGCGTACCAATTCACT-3E055-GACTGCGTACCAATTCAGG-3E065-GACTGCGTACCAATTCAGT-3E075-GACTGCGTACCAATTCAG-3MC015-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3MC025-GATGAGTCCTGAGTAACCA-3MC035-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3MC045-GATGAGTCCTGAGTAACGA-3MC055-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3MC065-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3CMC025-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3CMC035-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3CMC045-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3MC105-GATGAGTCCTGAGTAACGT-3