CAR-T技术与肿瘤精准免疫治疗

CAR-T技术与肿瘤精准免疫治疗本文由爱康得生物原创2015年1月20日，美国总统奥巴马在国情咨文演讲中提出“精准医学计划”，一时间“精准医疗”成为一大热门词汇。在美国，精准医疗称为“PrecisionMedicine”，而早在百余年前的中国，中医就提出了“精准医疗”这一概念，称为“辩证施治”。肿瘤又被称为多基因疾病，其发病机理，疾病发展过程，疾病病症与表现在个体之间差存在异。肿瘤的发生因素很复杂，遗传因素，外环境与内环境以及体细胞与干细胞的DNA损伤与修复，导致基因突变的逐步积累，最终演变为各种癌症的发生（图1）。肿瘤发生的机理如基因突变，逆分化，肿瘤干细胞，免疫监视，端粒与端粒酶等等还有太多的未知领域。这些错综复杂的因素导致相同组织器官癌症引发的机理不一致，相同机理引发的癌症部位不一致。肿瘤的发生往往有数千个突变类型，每个病人的突变类型不一样，所以传统的治疗模式出现了许多困惑，如无法解释的耐药性，肿瘤基因组的异质性，有效治疗响应监测手段的缺乏等，在此时，精准治疗对于肿瘤的治疗十分重要。图1：肿瘤发生的复杂性。肿瘤的发生因素很复杂，遗传因素，外环境与内环境以及体细胞与干细胞的DNA损伤与修复，导致基因突变的逐步积累，最终演变为各种癌症的发生。肿瘤精准免疫治疗发展当前，广泛用于肿瘤精准免疫治疗的药物为靶向药物和单克隆抗体，其利用肿瘤细胞与正常细胞之间分子生物学上的差异（包括基因、酶、信号转导等不同特性），抑制肿瘤细胞的生长增殖，最后使其死亡。如用于治疗非小细胞肺癌的易瑞沙和特罗凯，用于治疗大肠癌的西妥昔单抗，用于治疗乳腺癌的曲妥珠单抗，用于治疗前列腺癌伊马替尼等。但肿瘤细胞十分狡猾，在靶向药物使用过程中，肿瘤为躲避药物的作用会产生突变，继而产生耐药使这类药物失去效力，如易瑞沙平均耐药时间约1年，特罗凯耐药时间还要更短些，大约在8个月左右。耐药后肿瘤进展十分迅速，病人不得不重新寻找其他治疗方法。2013年是值得纪念的一年，《科学》杂志评论作为2013年度最重要的科学突破的榜首——癌症的免疫疗法。其中以程序性死亡因子1抗体(anti-PD1)及其它免疫检查点抗体和嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T疗法）最受瞩目。PD-1在恶性黑色素瘤和肺鳞癌的治疗获得重大突破，被美国FDA批准用于临床。CAR-T在B细胞恶性肿瘤的治疗获得巨大成功，ALL完全缓解率达到惊人的90%。在此我们着重聊一聊CAR-T免疫疗法。CAR-T免疫疗法是通过整合嵌合抗原受体的基因修饰的T细胞来抵抗肿瘤细胞的疗法。嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖T细胞的信号传递至胞内，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。自1989年以色列魏茨曼科学研究所免疫学家ZeligEshhar将免疫球蛋白scFv与FcεRI受体(γ链)或CD3复合物(ζ链)胞内结构域融合并导入T细胞制备出第一代CAR-T以来，CAR-T经历了20余年的发展（图2）。CAR分子大致可分为5代演变：I代，特异性T细胞激活；II代，增加共刺激因子，提高细胞毒性；III代，同时具有两个共刺激因子，提高T细胞增殖能力与杀伤毒性；IV代，整合自杀基因，精确调控，细胞因子释放（如IL-7，IL-15）激活等；V代，通用型CAR（图3）。图2：CAR-T的发展历程图3：CAR分子的演变。I代，特异性T细胞激活；II代，增加共刺激因子，提高细胞毒性；III代，同时具有两个共刺激因子，提高T细胞增殖能力与杀伤毒性；IV代，整合自杀基因，精确调控，细胞因子释放（如IL-7，IL-15）激活等；V代，通用型CAR。CAR-T临床试验疗效与毒性在血液恶性肿瘤方面，2014年UPenn利用CD19-CAR-T细胞治疗复发难治性B-ALL，完全缓解率达90%；2015年ASCO会议，MSKCC公布一组数据，CD19-CAR-T治疗B-ALL，32例受试者有29例获完全缓解，CR率达91%。在治疗实体瘤方面，利用HER2-CAR-T治疗HER2+肉瘤患者，共19例患者参与临床实验，输注CAR-T细胞数量逐步升高，无明显CAR-T毒性，部分瘤内有少量T细胞浸润，4例稳定病情达12周~14个月，中位生存期10.3月（5.1~29.1个月）（图4）；Mesothelin是一个肿瘤相关抗原，在很多恶性胸膜间皮瘤中广泛高表达。以Meso为靶点，通过在T细胞上瞬时表达CAR分子，经静脉回输外加瘤内注射的方式对2例入选患者进行治疗，未出现明显的副作用，CAR-T细胞在两例患者体内均体现了一定的抗肿瘤活性，患者腹水中的Mesothelin阳性的肿瘤细胞数量明显减少（图5）。图4：HER2-CAR-T治疗HER2+肉瘤患临床疗效观察。部分瘤内有少量T细胞浸润，4例稳定病情达12周~14个月，中位生存期10.3月（5.1~29.1个月）。图5：以Meso为靶点，通过在T细胞上瞬时表达CAR分子，经静脉回输外加瘤内注射的方式对2例入选患者进行治疗，未出现明显的副作用，CAR-T细胞在两例患者体内均体现了一定的抗肿瘤活性，患者腹水中的Mesothelin阳性的肿瘤细胞数量明显减少。接受CAR-T治疗的患者会出现毒性反应。如寒战，发热，白细胞减少，溶瘤综合症，巨噬细胞活化综合症，细胞因子风暴，B细胞缺乏及低丙种球蛋白血症，脱靶效应（ontarget/offtumor）等。其中几乎所有接受CAR-T细胞治疗并且出现应答的患者都会出现细胞因子风暴，这与T细胞的激活直接相关，而肿瘤负荷影响细胞因子风暴的级别（分为1~4级）。通过输注前化疗预处理，使用输注细胞剂量递增方案，并严密监测血清相关指标，如IL-6水平，C-反应蛋白等。利用IL-6拮抗剂如Tocilizumab可治疗严重细胞因子风暴，并且不会影响CAR-T疗效。脱靶效应常见于CAR-T治疗实体瘤患者中，由于靶向抗原在正常组织中也低表达，导致CAR-T细胞攻击人正常组织，如人肺组织会低表达Her2，Her2-CAR-T细胞可引起致命的肺毒性。通过降低scFv亲和力，局部瘤内注射，寻找肿瘤特异性抗原等方法来减少或避免这类毒性的发生。由此可见，目前CAR-T细胞治疗还不够精准。CAR-T临床试验数据统计与治疗方案研究截至2015年10月，全球共计110项CAR-T临床试验在ClinicalTrials.gov注册，其中大部分为血液肿瘤的临床试验，实体瘤占38项，均为I/II期临床试验（表1），血液肿瘤靶点选择最多的是CD19,实体瘤主要靶点选择是EGFR,GD2,CEA,Her2（图6）。表1：CAR-T实体瘤临床试验在ClinicalTrials.gov注册情况（截至2015.10）图6：实体瘤靶向抗原选择比例图在临床试验中，血液肿瘤的CAR-T治疗方案为：在获得临床试验批准后，首先根据入选与排除标准筛选受试者，与受试者签署知情同意书后对其病情进行评估，采集分离PBMC，经T细胞分选，CAR病毒感染，洗脱扩增，质控检测后收获CAR-T细胞。在细胞输注前4天完成化疗预处理。连续3天按10%，30%，60%的剂量递增方式输注CAR-T细胞。输注实体瘤靶向抗原EGFRHer2CEAGD2PSMASS1cMetVEGFRFAPIL-13R后半年内月度随访和半年后的季度随访，以及15年后的转基因跟踪。实体肿瘤的CAR-T治疗没有获得如血液肿瘤治疗后的惊人疗效。实体肿瘤的治疗情况相对复杂多变。首实体肿瘤致密结构特点阻碍了CAR-T对肿瘤组织的浸润，导致实体瘤内部没有足够的T效应T细胞；再者肿瘤微环境中存在免疫负调节因素的制约，如免疫抑制性细胞的存在（regulatoryTcells,myeloidderivedsuppressorcells,andM2tumor-associatedmacrophages），抑制性细胞因子（TGF-β,IL-10），肿瘤细胞表面表达的T细胞功能抑制性蛋白分子(B7-Hfamilymembers,Fasligand)，引导CAR-T向肿瘤灶归巢的趋化因子等。所以，CAR-T细胞输注前患者预处理方案，如何让CAR-T细胞在体内有效增殖并保持高杀瘤活性，如何使CAR-T细胞有效浸润在实体瘤内部等一系列问题尚待进一步研究。如使用CT模拟定位三维适形放疗技术对实体瘤进行预处理，或用微创介入或瘤内注射的方式，使CAR-T细胞更多地进入到实体瘤内部对靶细胞进行有效杀伤。另外可以将CAR-T负载溶瘤病毒以提高对实体瘤治疗的效果（详见《CAR-T细胞与溶瘤病毒联用》一文）。小结精准医疗是未来疾病治疗的发展方向，但是目前肿瘤的精准治疗长路漫漫。如果将肿瘤比喻为阴，免疫系统比喻为阳，则阴阳之间相互对立，相互统一，相互制约，消长与共（图7）。图7：肿瘤与免疫治疗之间相互对立，相互统一，相互制约，消长与共仅依靠细胞治疗肿瘤还远远不够。手术，化疗，放疗可以迅速降低肿瘤负荷，特异性治疗如CAR-T,TCR-T,抗体药物等可以迅速锁定并杀伤肿瘤细胞，但是肿瘤而且很容易产生突变，使用非特异性治疗如DC疫苗，免疫增强剂来清除残余的肿瘤细胞。随着基因测序，分子生物学技术，影像技术，大数据等快速发展，肿瘤的精准治疗也会得到长足的发展，并成为未来肿瘤综合治疗的主要模式。不过在最后笔者认为，对于肿瘤，做到健康规律的生活方式，高危人群定期进行健康体检，以预防为主，早发现，及时并且根据病情进行综合治疗，方为正道。