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中国组织工程研究第20卷第32期2016–08–05出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchAugust5,2016Vol.20,No.32P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·翟晓建，男，1979年生，河南省南阳市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事乳腺甲状腺疾病的研究与治疗。中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)32-04758-06稿件接受：2016-06-17CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞活性与多药耐药的相关性翟晓建1，张浩1，张旖旎2，倪鸣3，王征1(1南阳市中心医院乳腺甲状腺外科，河南省南阳市473003；2南昌大学江西医学院，江西省南昌市330000；3南阳市中心医院妇三科，河南省南阳市473003)引用本文：翟晓建，张浩，张旖旎，倪鸣，王征.CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞活性与多药耐药的相关性[J].中国组织工程研究，2016，20(32):4758-4763.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.007ORCID:0000-0002-6165-090X(翟晓建)文章快速阅读：文题释义：肿瘤放疗和化疗中的肿瘤干细胞：因其具有很强耐受力，不容易被摧毁。目前肿瘤化疗药物主要是针对处于分裂周期的细胞，而肿瘤干细胞多处于静息期休眠状态，对化疗药物的敏感性差，这就是肿瘤化疗后缩小，而停药后仍可能原位复发的原因。近年来肿瘤干细胞学说越来越受到科学家的关注，目前已经成功在脑肿瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤中成功分离出了肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的提出为肿瘤发生和复发机制提供了合理解释，对于研发更有效的抗肿瘤药物及干细胞和细胞生物学研究均具有重大意义。但是，对肿瘤干细胞耐药的机制、自噬对肿瘤干细胞干性的影响、肿瘤干细胞由休眠到激活的调控等，都还需要长期的研究。多药耐药：是导致肿瘤治疗失败的主要原因之一，肿瘤患者围手术期的化疗是控制复发转移的主要手段。通过对不同类型肿瘤耐药表型的研究，可以揭示其耐药特征，进而分析耐药基因表达与临床病理和预后的相关性，对提高治疗效果具有重要的临床意义。摘要背景：肿瘤干细胞与肿瘤的复发、转移以及耐药等之间存在十分密切的联系。目的：探讨CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞活性与多药耐药的相关性。方法：运用免疫磁珠法从多药耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中分选出CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞。流式细胞仪测定分选后CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞亚群比例和细胞膜P-gp荧光强度，RT-PCR法检测多药耐药基因MDRmRNA表达水平。结果与结论：①获得的CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞比例在90%以上；②CD44+CD24-/low细胞亚群成球比例明显强于non-CD44+CD24-/low细胞亚群；③CD44+CD24-/low细胞亚群的细胞膜P-gp荧光强度显著高于MFC-7/ADR细胞株(P0.05)；④CD44+CD24-/low细胞亚群的MDRmRNA表达水平显著高于MFC-7/ADR细胞株(P0.05)；⑤结果表明，分选得到的CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞具有很强的体外成球能力，高表达P-gp蛋白和MDRmRNA可能是导致多药耐药的原因之一。关键词：干细胞；肿瘤干细胞；乳腺癌；细胞活性；细胞分选；多药耐药；体外成球实验；耐药基因主题词：乳腺肿瘤；肿瘤干细胞；P糖蛋白；抗药性,肿瘤；抗原,CD44；抗原,CD24；组织工程CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞体外分选与耐药性多药耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR培养CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞分选(1)体外成球实验(2)流式细胞仪检测细胞膜P-gp荧光强度(3)RT-PCR检测MDRmRNA表达翟晓建，等.CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞活性与多药耐药的相关性ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4759(1DepartmentofBreastandThyroidSurgery,3ThirdDepartmentofGynecology,NanyangCentralHospital,Nanyang473003,HenanProvince,China;2NanchangUniversityMedicalSchool,Nanchang330000,JiangxiProvince,China)AbstractBACKGROUND:Tumorstemcellsarefoundtobeinvolvedintherecurrence,metastasisanddrugresistanceofthetumor.OBJECTIVE:ToexploretherelationshipbetweencellactivityandmultidrugresistanceofCD44+CD24-/lowbreastcancerstemcells.METHODS:CD44+CD24-/lowbreastcancerstemcellssortedfrommultidrugresistantbreastcancercelllineMCF-7/ADRweredetectedaspercentageusingflowcytometry.P-gpfluorescenceintensityofthecellmembraneandMDRmRNAexpressioninsortedcellsandMCF-7/ADRweredetectedusingflowcytometryandRT-PCR,respectively.RESULTSANDCONCLUSION:Aftersortingbyflowcytometry,theproportionofCD44+CD24-/lowbreastcancerstemcellswasmorethan90%,indicatingthatthesortedcellscouldmeettheneedsofthesubsequentexperiment.CD44+CD24-/lowcellsubsetsexhibitedstrongerabilitytoformmicrospheresthannon-CD44+CD24-/lowcellsubsets.TheP-gpfluorescenceintensityandMDRmRNAexpressionofCD44+CD24-/lowcellsweresignificantlyhigherthanthoseofMFC-7/ADRcellline(P0.05).TheseexperimentalfindingssuggestthatCD44+CD24-/lowbreastcancerstemcellssortedfromMCF-7/ADRcelllineshaveastrongabilitytoformcellmicrospheresinvitro,andsignificantlyraisethelevelofP-gpproteinandMDRmRNAexpression,whichmaybeoneofthecausesofmultidrugresistance.Subjectheadings:BreastNeoplasms;NeoplasticStemCells;P-Glycoprotein;DrugResistance,Neoplasm;Antigens,CD44;Antigens,CD24;TissueEngineeringCitethisarticle:ZhaiXJ,ZhangH,ZhangYN,NiM,WangZ.RelationshipbetweencellactivityandmultidrugresistanceofCD44+CD24-/lowbreastcancerstemcells.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(32):4758-4763.0引言Introduction肿瘤治疗过程中，容易出现耐药现象，影响预后[1]。通过对肿瘤耐药相关问题进行研究后发现，肿瘤干细胞与肿瘤耐药之间密切相关[2]。肿瘤干细胞学说认为，肿瘤产生的根本原因是肿瘤干细胞的产生，只有消灭了肿瘤干细胞才能真正治愈肿瘤[3]。传统的手术、放化疗并不能完全消灭肿瘤干细胞。正常的组织干细胞具有的特点可以归纳为：①数量极少；②未分化或低分化状态；③自我更新能力；④多向分化或定向分化；⑤端粒酶活性高；⑥具有特异的标记物。基于正常干细胞理论，人们提出了肿瘤干细胞学说，认为肿瘤中那些具有自我更新、多向分化和重建肿瘤组织能力的细胞是肿瘤干细胞[4]。在乳腺癌组织中，也存在一小部分具有干细胞样特性的细胞，其具有自我更新、无限增殖以及多向分化能力，即乳腺癌干细胞。研究认为其是导致肿瘤复发、转移、耐药的根源。为了提高治疗效果，需要积极对乳腺癌干细胞相关生物学特性进行研究[5-7]。寻找和鉴定特异性的肿瘤干细胞分子表面标记物，是肿瘤干细胞靶向治疗的关键，实验采用免疫磁珠法从乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中获得CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞[8]，探讨其与多药耐药的相关性。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计体外观察性实验。1.2时间及地点实验于2016年1至2月在南阳市中心医院实验室完成。1.3材料乳腺癌细胞株MCF-7/ADR由上海华研生物科技有限公司提供。1.4实验方法1.4.1多药耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR培养[9]将多药耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR接种于含体积分数为10%小牛血清、160U/L胰岛素、100mg/L链霉素和100U/mL青霉素的RPMI1640培养液中，在37℃、体积分数为5%CO2培养箱培养。1.4.2CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞分选[10]取对数期多药耐药乳腺癌MCF-7/ADR细胞，消化、离心、制备单细胞悬液，添加10μLCD24-Biotin充分混合均匀，孵育15min后添加20μLAnti-biotinMicroBeads，充分翟晓建，等.CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞活性与多药耐药的相关性P.O.Box10002,Shenyang110180混合均匀，孵育15min后进行离心，利用MACD分选系统获得CD24-/low细胞，并按照上述相同的步骤进行分选，最终获得CD44+CD24-/low细胞。1.4.3流式细胞仪检测CD44+CD24-/low细胞比例[11]取生长良好的CD44+CD24-/low细胞亚群，PBS洗涤后制备单细胞悬液，添加5μL鼠抗人CD24-FITC和0.625μL兔抗人CD44-PE，置于避光环境下孵育0.5h，流式细胞仪检测CD44+CD24-/low细胞比例。1.4.4体外成球实验[12-13]取生长良好的CD44+CD24-/low细胞亚群和non-CD44+CD24-/low细胞