cDNA第二链合成

1.SupersciptII―RT合成第一链:1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入xulmRNA(大约500ng)1ulXhoIPrimer(1.4ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)11-xulRNase-freewater（大于500ngmRNA分n管(500ng/tube)合成第一链,第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）2.混匀后,70℃反应10分钟;3.反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;4.稍微离心一下,顺序加入以下试剂:4ul5×firststrandbuffer2ul0.1MDTT1ul10mMdNTP(自己配制)5.混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;6.反应完成,趁热加入1ulSupersciptII―RT,混匀;7.42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.2.cDNA第二链的合成:1.第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):20ul10×DNAPolymeraseIbuffer6ul10mMdNTP(自己配制)xulddH2O1ulRNaseH(2U/ul)10ulDNAPolymeraseI(10U/ul)总体系为200ul;2.混匀后,16℃反应2.5小时;3.70℃灭活10分钟;4.反应完成后,得到200ulcDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kbladder，确定双链的大小范围。注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。3.双链cDNA末端补平:1.在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):6ul10mMdNTP2ulT4DNAPolymerase(8.7U/ul)2ulBSA(10mg/ml)2.稍微离心混匀反应物,37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;4.离心后,吸取上清于另一1.5mleppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;5.吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3MNaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;6.第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕,弃上清,加入1ml70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.注：第3，第4步可以用PCR纯化试剂盒代替。PCR纯化试剂盒操作流程：1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的bufferPB，混匀。3．加入spincolumn中，13000rpm离心1min。4．加入0.75mlbufferPE，13000rpm离心1min。5．13000rpm，再离心1min。6．将spincolumn放入一新的离心管中，加入50ulbufferEB，静置10min。7．13000rpm离心2min。8．加入30ulbufferEB，静置10min。9．13000rpm离心2min。10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。4EcoRIadaptor加接:1.往双链cDNA沉淀中加入9ulEcoRIadaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;2.溶解完成后,顺序加入下列试剂:1.2ul10×LigaseBuffer1ul10mMrATP1ulT4DNALigase(4U/ul)3.混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;5双链cDNA末端的磷酸化及XhoI酶切:1.连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4DNALigase;2.稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:1ul10×LigaseBuffer1ul10mMrATP6ulddH2O1ulT4PNK(10U/ul)3.37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;4.稍微离心使反应物集中至管底;5.室温放置5分钟;然后加入下列试剂:4ulXho10×Buffer2ulBSA5ulddH2O8ulXhoI(10U/ul)6.37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;7.反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。6.胶回收cDNA(QIAEXIIGELExtractionKit回收试剂盒)1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ulEB/300ml胶2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。3．电泳50V；1hr4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kbcDNA片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。5．称取胶重，加入三倍体积bufferQXI（例如，100mg胶中加入300ulbufferQXI）6．50℃水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹QIAEXII使重悬，每管中加入5ulQIAEXII7．50℃水浴10min，每隔2min取出颠倒混匀数次，使QIAEXII保持悬浮8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）9．加入500ulbufferQXI，轻弹管底使QIAEXII重悬10．离心并去上清（同操作8）11．加入500ulbufferPE，重悬QIAEXII，离心30sec，去上清12．再加入500ulbufferPE，重悬QIAEXII，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清13．超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ulelutionbuffer，重悬QIAEXII，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。14．取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kbladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。15．将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。注意事项：1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1％的HCl浸泡过夜。2．胶回收时电压要稳定。