Chapter6DNArecombination

Chapter6DNArecombinationContents:1、同源重组2、位点特异性重组3、DNA的转座第一节同源重组一、概述：1、定义：两个DNA分子同源序列之间进行的重组2、条件：（1）两个DNA分子有同源序列（2）两个DNA分子必须紧密接触3、发生：真核生物:非姐妹染色单体交换相对应的区域。原核生物:依赖recA蛋白，并形成Holliday结构Holiday模型（1964年）二、Holiday重组模型1、两个同源DNA分子排列在一起；2、两个同源DNA分子各有一条链断裂3、游离端交叉连接，形成Holliday结构4、通过分支迁移产生异源双链DNA5、空间重排和解离.6、垂直切割导致重组发生7、水平切割不会导致重组，而产生两段短的杂合链三、细菌的同源重组1、参与细菌的同源重组的因子（1）RecA:包裹单链DNA;促进单链吸收（2）RecBCD复合体（3）RuvAB复合体：促进分支迁移（4）RuvC：使Holliday结构解离（5）SSB（6）Ligase:封闭切口（1）RecA:促进单链同化或单链吸收单链同化发生的三个条件其中一个DNA必须存在单链区其中一个DNA必须有一个自由3’末端此单链区和3’末端必须位于两分子之间互补的区域内RecA包裹的ssDNA入侵双螺旋DNA（2）RecBCD复合体三种酶的活性：核酸酶；解旋酶；ATPase作用：在Chi位点处产生含3’游离未端单链.Chi位点---RecBCD识别的靶位点5'GCTGGTGG3'3'CGACCACC5'是重组频率较高的部位E.coli中每隔约5~10kb有一个拷贝（3）RuvAB复合体:促进分支迁移RuvA：识别Holliday结构RuvB：解旋酶（具有ATP酶活性）（4）RuvC：切割结构2、细菌DNA同源重组的过程(a)通过RecBCD复合体的作用在Chi位点产生切口；(b)ssDNA被recA包裹形成recA-ssDNA细丝(c)RecA-ssDNA细丝入侵双螺旋DNA(d)RecA帮助入侵单链寻找同源序列.(e)切割;单链交换(f)连接酶封闭切口,产生Holliday结构(g)在RuvA和RuvB作用下发生分支迁移.(h)RuvC使Holliday结构解离第二节位点特异性重组一、定义：不依赖于DNA顺序的同源性，而依赖于能与某些酶相结合的特异的DNA序列的存在。二、噬菌体λ对E.coliDNA的整合（一）λDNA存在两种形式裂解状态溶源状态（二）通过位点特异性重组实现两种类型间的转换λDNA整合到宿主DNA→进入溶源状态λDNA从宿主DNA中切离→进入裂解状态（三）催化重组的酶1、整合酶Int(integrase)：类似拓扑异构酶活性2、整合宿主因子（IHF，integrationhostfactor）3、切除酶（excisionase）（四）重组位点：附着位点（attachmentsite）attP（POP’）和attB（BOB’）有15bp核心序列配对（五）重组过程：整合：POP’+BOB’→BOP’—POB’切离：BOP’—POB’→POP’+BOB’第三节转座一、转座子的概念：基因组中可转移座位的一段DNA序列转座：一个转座子由基因组的一个位置转移到另一个位置的过程二、转座子发现：McClintockB：1938年，提出转座基因概念1944-1950，阐明“Ds-Ac调控系统”1983年，获诺贝尔生理医学奖三、转座子的基本结构特点1、自身携带有转座酶基因2、末端有反向重复序列（IR）3、转座后两端有正向重复序列（DR）ATGCA12345678TACGT1234567887654321ATGCA87654321TACGT转座酶基因插入序列（insertionsequences，IS）四、转座子的类型（一）细菌转座子1、IS（插入序列,insertionsequences）特点（1）比较小，0.75~1.5kb;（2）只有转座酶基因（3）两端有反向重复序列;IR（invertedrepeat）ISTransposaseIRATGCA12345678TACGT1234567887654321ATGCA87654321TACGTTargetrepeatInvertedrepeatIS19bp23bp768bpIS25bp41bp1327bpIS411-13bp18bp1428bpIS54bp16bp1195bpIS10R9bp22bp1329bpIS50R9bp9bp1531bpIS9039bp18bp1057bpATGCATACGT2、Tn（复合转座子,compositetransposons）特点：（1）2-10kb;;（2）两端有两个相同或高度同源IS序列（3）含转座酶基因/抗生素抗性基因TransposonmakersTnISISISLISRTransposonmakersTransposonmakersTn9IS1camRISmodulsidenticalbothfunctionalTn903IS903kanRbothISfunctionalTn10IS10LtetRIS10RnonfunctionalfunctionalTn5IS50LkanRIS50Rnonfunctionalfunctional3、TnA（TnAfamily）特点：（1）5~25kb;（2）两端IR（30~40bp）相似或相同；两端无IS组件;（3）转座酶基因/解离酶基因/抗生素抗性基因（4）Res位点：与共整合体的解离有关TnAResTransposaseResolvaseAmprIRIR（二）真核生物转座子1、特点：（1）两端有IR，（2）内部有转座酶等基因；2、举例：玉米转座子Ac/Ds，Spm/dSpm；果蝇P因子（一）转座相关的酶1、转座酶:（1）识别转座子的两端序列和受体DNA的靶序列（2）切割使转座子从供体DNA中释放出来（3）在靶位点上作出交错的切割(类似限制酶)（4）催化一对转酯反应，使转座子3’端与靶位点相连2、解离酶:（1）TnA家族转座必须（2）催化两个转座子拷贝间的位点特异性重组五、转座机制（二）非复制型转座ATGCATACGT插入ATGCATACGTATGCATACGT补齐ATGCATACGT剪切1、非复制型转座定义转座子作为一个可移动的单位直接被移位，留下一个断裂的供体位点。2、非复制型转座过程（1）转座酶使转座子从供体DNA中释放出来；转座酶使受体DNA靶位点形成交错切口；（2）转座子插入交错切口(转座酶--转酯反应)，（3）连接并修复缺口单链，受体DNA产生同向重复序列。（三）复制型转座1、定义：整个转座子被复制，所移动和转位的仅仅是原转座子的拷贝。1abcdefgh2acbdeghf3acbdeghf4egbdacfh5acegbdfh2、复制型转座过程：（1）转座酶使转座子和受体DNA双链形成交错切口；（2）转座子两端形成复制叉，复制、连接补齐缺口，形成共整合体；（3）重组(解离酶)，拆分共整合体；（4）受体DNA产生同向复序列。314234共整合体转座机制六、转座频率和转座抑制（一）转座频率不同转座元件的转座频率不同。一般为每代10-3~10-4次/元件，可能与转座酶的水平有关。（二）转座抑制1、DNA甲基化抑制转座子的活动2、RNAsilencing抑制转座子的活动七、转座作用的遗传学效应1、可引起基因突变——插入或切离；2、可以产生新基因；3、影响插入位置邻近基因的表达4、转座产生染色体畸变（缺失、倒位等）八、转座生物学效应举例DsDsColorgeneAc自主性因子：能自主转座，如Ac非自主性因子：不能自主转座，当基因组中存在与其同家族的自主性因子时，才具备转座功能，如Ds九、转座子的应用功能基因组研究植物：转座子标签---拟南芥、水稻突变体库动物：PB因子---小鼠突变体一、反转录病毒（一）反转录病毒的生活周期（1）病毒粒子侵染细胞，病毒RNA和反转录酶一起进入细胞。（2）RNA被反转录成双链DNA（前病毒），进入细胞核。（3）反转录病毒的DNA整合到宿主染色体DNA中。第四节反转录病毒和反转座子（4）前病毒DNA进行复制；转录产生RNA并翻译出病毒蛋白。（5）基因组RNA和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子，转移到质膜，通过出芽方式释放新病毒粒子HIV从受感染细胞的质膜出芽的情形（二）反转录病毒的基因组1、三个基因：gag基因：编码病毒的核心蛋白pol基因：编码反转录酶和整合酶env基因：编码病毒的包膜糖蛋白2、5’帽子，3’poly（A）3、重复序列（R）：10~80nt，5’、3’端各一4、U5序列：80~100nt，5’端特有5、U3序列：170~1260nt，3’端特有（三）前病毒DNA长末端重复序列（longterminalrepeats，LTR）1、结构：U3-R-U52、U3区：有启动子；左边U3区启动子负责启动前病毒的转录3、作用：对病毒DNA整合进宿主细胞基因组和控制病毒RNA合成都有重要作用（四）RNA指导的DNA合成（反转录）1、反转录（reversetranscription）：在反转录酶的作用下，以RNA为模板合DNA的过程。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。2、反转录酶具有三种酶活性（1）RNA指导的DNA聚合酶活性（2）RNaseH酶活力，水解RNA-DNA杂种分子中的RNA。（3）DNA指导的DNA聚合酶活性。RNARNADNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(+)1.RNA指导DNA合成2.RNA水解3.DNA指导DNA合成3、反转录的过程引物：tRNA（五）反转录病毒整合的机制1、整合酶在LTRs的3’端切去两个碱基2、整合酶在靶DNA产生交错切口3、整合酶将LTR的3’凹端与靶DNA的5’端连接4、切去5’端两个碱基，连接并修复缺口，产生同向重复序列（一）概念：通过RNA为中介，反转录为DNA后进行转座的可移动元件（DNA→RNA→DNA→插入新位点）如：果蝇copia，酵母Ty1，拟南芥菜Ta1自私的DNA二、反转录转座子（retrotransposon）（二）类型1、病毒超家族（自主的反转座子）（1）编码反转录酶和整合酶，能自主地转座，转座机制同反转录病毒相似；（2）不能象反转录病毒一样以独立感染的方式进行传播（3）有LTR结构2、非病毒超家族（非自主的反转座子）（1）不能编码反转录酶和整合酶，不能自主转座，而在细胞内已有酶系统作用下进行转座（2）没有LTR结构Mechanismofretrotransposition（三）反转座子举例1、L1家族（1）属于自主的反转座子（2）长6500bp左右（3）是一种长散在元件（LINEs）（4）由RNA聚合酶II转录的。（5）在人类基因组中大于1万个拷贝2、Alu家族（1）在170bp处有一AluI的酶切位点；（2）属于非自主的反转座子（3）长约300bp；是一种短散在元件(SINEs)。（4）由RNA聚合酶III转录的。（5）在人类基因组中有100万个拷贝；3、加工假基因（1）是一种非自主的反转座子（2）缺少正常的内含子；（3）3’末端有多聚腺苷酸；（4）5’端的结构和mRNA的5’端十分相似；（5）两侧有正向重复顺序的存在。（6）来源于RNA聚合酶II的转录产物（四）反转座子的生物学意义1.对基因表达的影响2.介导基因重排3.在生物进化中的作用在进化过程中，反转座作用是新基因形成和基因组复杂性提高的主要因素Question名词解释：DNA重组（遗传重组）、同源重组、转座、复制性转座、非复制性转座、反转座子简答题：1、简述RecA、RecBCD的作用及细菌同源重组的机制2、试述转座的机制和遗传学效应思考题：转座(transposition)与易位(translocation)有什么不同？它们各自有哪些类型？对于基因组的进化各有哪些意义？