Chapter8RNAprocessing.

Chapter8RNAprocessing一、RNA的加工：将各种前体RNA分子加工成成熟的、有活性的RNA的过程二、场所：主要是在细胞核内进行第一节概述三、RNA加工的类型：1、剪切：就是剪去部分序列；2、剪接：是指剪切后又将某些片段连接起来。3、末端添加核苷酸：如tRNA的3′-末端添加-CCA。4、修饰：在碱基及核糖分子进行化学修饰。5、RNA编辑：某些RNA，特别是mRNA自DNA模板上所获得的遗传信息，在转录后又发生了变化。一、原核生物rRNA的加工第二节rRNA的加工16SrRNA23SrRNA5SrRNAtRNAtRNA大肠杆菌最初的转录物（30S）1、核糖核蛋白复合体（RNP）形成初生转录物形成一些茎环结构，随后与一些蛋白结合形成核糖核蛋白复合体（RNP）茎环结构RNP原核生物rRNA的加工（RNA酶Ⅲ）2、甲基化修饰：（通常是A）甲基供体--S-腺苷甲硫氨酸3、剪切：（1）RnaseⅢ剪切释放出5S，16S，23S前体分子；（2）随后RNA酶M5,M16,M23分别在每一前体分子的5’端和3’端进行剪切。二、真核细胞rRNA的加工（一）概述1、rRNA基因：RNA聚合酶Ⅰ转录—转录物需要加工2、5srRNA基因：RNA聚合酶Ⅲ转录--转录物一般不需加工Mammals18SrRNA5.8SrRNA28SrRNA47Spre-rRNA(13500nt)100site2’-O-methlsnoRNPMaturerRNAsETS1ITS1ITS2ETS245Spre-rRNA41Spre-rRNA20S+32Spre-rRNA5.8S-28SBasepair（二）真核细胞rRNA前体的加工过程18SrRNA5.8SrRNA28SrRNA（1）广泛地进行甲基化修饰，主要是在28S及18S中。（2）除掉外部转录间隔区(ETS)1和2，再切去内部转录间隔区（ITS），释放出32S和20S的两个前RNA。（3）随后45SrRNA前体经核酸酶顺序剪切下生成18S、5.8S、28SrRNA。真核细胞rRNA前体的加工过程第三节tRNA的加工一、原核生物tRNA的加工1、tRNA的编码序列大肠杆菌rRNA操纵子中含有tRNA的编码序列tRNA的操纵子：含7个tRNA基因2、原核生物tRNA的加工过程初始转录物RNaseD,E,FandP具有成熟末端的tRNABasemodification成熟tRNA1.内切核酸酶（RnaseE、F）在3‘端切除一个侧翼序列，在前体的3’端留下一个额外的九核苷酸2.外切酶RNaseD依次切去3’端的7个核苷酸3.内切酶RNaseP切除5’端的一段，产生成熟的5’端4.外切酶RNaseD继续除去3’端剩余的两个核苷酸直至CCA，产生成熟的3’端34Modifiedbases二、真核生物tRNA的加工1、tRNA前体5’端有16nt的前导序列14nt内含子3’端有2个额外的核苷酸2、真核生物tRNA的加工的过程去除5’前导序列和3’额外的核苷酸3’端添加CCA，产生成熟3’端内含子的剪接碱基修饰CCA的添加tRNA核苷酸转移酶（tRNAnucleotidyltransferase）三、真核tRNA的加工和原核的区别1、真核tRNA前体中无二聚体和多聚体；2、增加了剪接内含子的过程；3、真核生物CCA多由tRNA核苷酸转移酶添加，而原核多由tRNA基因编码。第四节前体mRNA的加工原核真核geneOperonintronmRNAPolycistronicmonocistronicPre-mRNAmRNAprocessing5’-cap,poly(A)tailLonger-livedTransporttocytoplasm一、原核生物与真核生物基因表达的差异二、核内不均一RNA（hnRNA）--RNApolⅡ的产物hnRNP：hnRNA+蛋白前mRNAsnRNP：snRNA+蛋白功能：参与前mRNA的剪接三、真核生物前mRNA加工过程前mRNA加工过程5’端加帽（5’-capping）3’端加尾剪接（splicing）甲基化修饰（methylation）（一）5’端加帽（5’-capping）1、三种5’帽结构形式帽0m7GpppNpN帽1m7GpppNmpN帽2m7GpppNmpNm2、5’帽的作用：（1）防止被5’外切核酸酶降解（2）翻译时可被起始因子和核糖体识别（3）有助于mRNA越过核膜，进入胞质（4）提高mRNA的剪接效率3、5-capping:m7G(5’-5’,mRNAguanyltransferase鸟苷转移酶)Base1:2’-OH甲基化；A(N6-甲基化)Base2:2’-OH甲基化5pppNp…5GpppNp…pppGppi鸟苷酸转移酶5m7GpppNp…甲基转移酶SAM5ppNp…磷酸酶Pi真核生物mRNA转录后加工--“加帽”（1）mRNA5′末端pppNp在磷酸酶作用下脱Pi，形成ppNp-。（2）在鸟苷酸转移酶作用下，与Gppp反应形成GpppNp-,连接方式为5’-5’三磷酸桥。（3）在甲基转移酶作用下，由腺苷蛋氨酸(SAM)提供甲基，在鸟嘌呤的N-7上甲基化（4）在连接于鸟苷酸的第一个（或第二个）核苷酸2－OH上又进行甲基化，最后形成m7GpppNmp。（二）3’端加尾1、3’端:poly(A)poly(A)聚合酶--Poly(A)polymerase(PAP);poly(A)＋：大部分真核mRNA有poly(A)尾巴poly(A)－：无poly(A)尾巴，如组蛋白的mRNA2、作用：（1）稳定mRNA（2）有助于mRNA从核到细胞质转运（3）翻译时可被起始因子和核糖体识别（4）提高mRNA的剪接效率3’末端多聚A尾的生成InitiationelongationAAUAAA5’capAAUAAAAn5’capPoly(A)polymeraseEndonucleases3、3’末端多聚A尾的生成（1）识别因子识别AAUAAA（2）剪切因子(CF)在加尾位点AAUAAA下游11－30nt处剪切RNA；（3）poly(A)聚合酶合成poly(A)尾巴；AAUAAA(20bp)CA5’UUGUGUGUUG3’PolyadenylationsignalCleavagesitepolyAadditionsiteGC-richregion第五节内含子的剪接一、核酶(Ribozyme)是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类具有催化功能的物质。1、发现1981年，T.Cech四膜虫rRNA内含子的剪接S.Altman，RNaseP2、类型：按结构锤头型核酶发夹型核酶按功能剪切型：相当于内切核酸酶剪接型：相当于内切核酸酶及连接酶其他类型：如核苷酸转移，脱磷酸作用3、核酶与传统酶的区别：（1）一般的酶是纯的蛋白质;而核酶是RNA或带蛋白的RNA；（2）有的核酶既是催化剂又是底物。而酶仅催化反应4、意义：①突破了酶的概念；②揭示了内含子自我剪接的奥秘；促进了RNA的研究③为生命的起源和分子进化提供了新的依据。二、前体mRNA的剪接（splicing）（一）前体mRNA的内含子GU-AG类（主要）AU-AC类（次要）G100U100A62A68G84T6312PyNC65A100G100A64G73N内含子外显子外显子左位点(5’/供体)右位点(3’/受体)分支点共同序列Py80NPy80Py87Pu75APy95GU-AG类内含子剪接位点的特征：（1）5’剪接位点（供体位点）为GU（2）3’剪接位点（受体位点）为AGGT-AGrule(GT-AG规则)：指在核基因内含子开始和结束出现的两个固定的脱氧核苷酸:5＇端为GT,3＇端为AG，与前体mRNA内含子剪接有关(Chambon法则)（3）分支部位：多聚嘧啶序列：Py80NPy80Py87Pu75APy95，（二）剪接体的形成1、剪接体（spliceosome）是由几种非特异的小核糖核蛋白(UsnRNP)与mRNA前体结合而成2、剪接因子（1）UsnRNPs：U1、U2、U5、U4/U6（2）化学组成：U-RNA+proteinsU-RNAs(uracilrichRNA)：UsnRNAs（3）特点：snRNP中的RNA成分与5’端和3’端剪接点及分支点的多种保守碱基配对RNA-RNAinteractionsbetweendifferentsnRNPs,andbetweensnRNPsandpre-mRNAU1U1U2U4/6U5U1U2U4/6U5U1U2OHOHUACUAACGUAGOHUACUAACUGAG3、剪接体的形成3、剪接体的形成：（1）U1snRNP识别mRNA前体的5′末端剪接位点，并与其互补而结合（2）U2snRNP识别并结合于分支部位（3）U5snRNP，识别并结合于内含子3′末端剪接位点（4）U4，U6也参加到剪接体中，起配合作用（5）mRNA与snRNP形成复合体---剪接体GUAGAUGAGAGUAGA套索结构套索的形成及剪接12123’-OH（三）前体mRNA的内含子的剪接1、分支点A的2′-OH攻击5′端交界处的磷酸二酯键，形成套索（lariat）结构2、切下的外显子1的3′-OH攻击内含子3′端的交界处磷酸二酯键，同时释放出套索状的内含子。（四）选择性剪接(alternativesplicing)一个基因的转录产物在不同的发育阶段和生理状态下，通过不同的剪接方式，可得到不同的mRNA和翻译产物2、选择性剪接的类型（1）利用不同的启动子（2）利用不同的poly（A）添加位点（3）保留或缺失特定的外显子（4）保留特定的内含子PS外显子SPL外显子L外显子2外显子3DNA50b2800bp161bp4500bp205bp327bp初始转录本：在唾腺中转录成熟mRNA：1663nt初始转录本：在肝中转录成熟mRNA：1773nt图18-57小鼠淀粉酶(amy)基因利用不同启动子产生两个不同的mRNA（1）利用不同的启动子在唾液腺中，特定的转录因子使淀粉酶基因从上游启动子开始转录在肝细胞中，使用下游启动子DNA5’1234567893’TATATATAAATAAA1456789(在心脏中)190aaLC1mRNA20kbAUG(在砂囊中)149aaLC310kb2356789图18-58鸡肌球蛋白轻链前体mRNA在不同的组织中进行不同的选择性拼接（2）利用不同的poly（A）添加位点WXZWXZWXZ大鼠/型肌钙蛋白T内含子是相对的在型中是外显子而在型中是内含子（3）不同外显子、内含子的选择肌钙蛋白基因内含子交替剪切，产生/两种类型的蛋白(四)反式剪接1、顺式剪接（Cis-splicing）剪接过程发生在一个RNA分子的内部，即通过剪接将一个RNA分子的内含子去除，使外显子连接在一起。2、反式剪接（Trans-splicing）以两种不同来源的RNA前体分子为底物，经过剪接在成熟的mRNA非翻译部分接上一小段RNA片段（剪接前导序列或小外显子）锥虫可变表面糖蛋白前体RNA的反式拼接三、I型内含子的剪接（一）结构特点无GT-AG结构边界序列为5’U…..3’G;（二）I型内含子剪接的机制1、自由鸟苷酸的3’-OH作为亲核基团攻击内含子5’端的磷酸二酯键，从上游切开RNA链2、上游外显子的3’-OH作为亲核基团攻击内含子3’位核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子被完全切开3、上下游外显子通过新的磷酸二酯键相连UpAGpUpGOHUOHGpUpGAUpUrRNApGpGUpAUpU（三）I型内含子剪接的特点1、内含子自我催化断裂和连接（ribozymes）2、需要带有3’-OH的鸟苷酸参与3、两步转酯反应(transesterification)四、II型内含子的剪接介于GT-AG和I型内含子之间的类型（一）结构特点（1）边界序列为5′↓GUGCG……YnAG↓；（2）分支点顺序（branch-pointsequence）保守序列PyP