cDNA文库的构建

第二节cDNA文库的构建cDNA文库中的外源DNA片段是互补DNA（complementaryDNA,cDNA）。cDNA是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的双链cDNA。cDNA文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。cDNA文库的构建cDNA文库的构建共分四步（图8-2）：第一，细胞总RNA的提取和mRNA分离；第二，第一链cDNA合成；第三，第二链cDNA合成；第四，双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。图8-2：cDNA文库构建流程图一、RNA的分离cDNA文库构建是以mRNA为起始材料的，mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库和其它应用所必需进行的步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。目前纯化mRNA的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]链，由它与mRNA的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。1．mRNA的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力，mRNA的大小，总mRNA制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力。2．mRNA的丰度高丰度mRNA：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占50-90%。低丰度mRNA：含量0.5%被称为低丰度或稀有mRNA。3．mRNA的富集3.1按大小对mRNA进行分级分离3.2cDNA的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA，可避免降解mRNA,agarose分离大小易辨。3.3多聚核糖体的免疫学纯化法用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体。免疫亲和柱/A蛋白-Sepharose柱，单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白-spharose柱上，随后用EDTA解离下来，通过oligo（dT）层析分离mRNA。此法分离的mRNA只占总mRNA的0.01-0.05%。并非都可用，根据材料\来源\特异性来选择。二、cDNA第一链的合成由mRNA到cDNA的过程称为反转录，是由反转录酶（reversetranscriptase）催化的。常用的反转录酶有两种，即AMV（来自禽成髓细胞瘤病毒）和MMLV（来自Moloey鼠白血病病毒），二者都是依赖于RNA的DNA聚合酶，有5'--3'DNA聚合酶活性。合成DNA时需要引物引导，目前常用的引物主要有两种，即Oligo（dT）和随机引物。Oligo（dT）引物一般包含10～20个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成，随机引物一般是包含6～10个碱基的寡核苷酸短片段。Oligo（dT）引导的cDNA合成是在cDNA的合成过程中加入高浓度的Oligo（dT）引物，Oligo（dT）引物与mRNA的3'末端的poly（A）配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA。这种cDNA合成的方法在cDNA文库构建中应用极为普遍，其缺点主要是由于cDNA末端存在较长的poly（A）而影响cDNA测序。随机引物引导的cDNA合成是采用6－10个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定mRNA并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条mRNA链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的mRNA分子的5'-端序列。随机引物cDNA合成的方法不适合构建cDNA文库，一般用于克隆特定mRNA的5'末端，如RT-PCR和5'-RACE。三、cDNA第二链的合成即将上一步形成的mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。cDNA第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。1．自身引导法（图8-3）：首先用氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA链，解离的第一链cDNA的3'-末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链cDNA合成时的特性，原因至今未知，据推测可能是由帽子的特殊结构相关），并引导DNA聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的，再利用S1核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接。2．置换合成法（图8-4）：它是由一组酶共同控制，包括RNA酶H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶。mRNA－cDNA杂合双链中的mRNA链在RNA酶H作用下先形成很多切口，mRNA链就被切割成很多的小片段，这些小片段为大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ提供了合成第二链的引物。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ以第一链cDNA为模板合成一段段互补的cDNA片段。这些cDNA片段进而在DNA连接酶的作用下连接成一条链，即cDNA的第二链。遗留在5'-末端的一段很小的mRNA也被大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的5'3'核酸外切酶和RNA酶H降解，暴露出与第一链cDNA对应的3'-端部分序列。同时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的3'--5'核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链cDNA的3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。这种方法合成的cDNA在5'-端存在几个核苷酸缺失，但一般不影响编码区的完整。3．引导合成法（图8-5）本方法是Okayama和Berg1982提出的。首先是制备一端带有Poly（dG）的片段Ⅱ和带有Poly（dT）的载体片段Ⅰ，并用片段Ⅰ来代替Oligo（dT）进行cDNA第一链的合成，在第一链cDNA合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，同时进行酶切创造出另一端的粘端，与片段Ⅱ一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在RNA酶H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链cDNA。其主要特点是合成全长cDNA的比例较高，但操作比较复杂，形成的cDNA克隆中都带有一段Poly（dC）/（dA），对重组子的复制和测序都不利。图8-5：引导合成法合成cDNA第二链4．引物－衔接头合成法是Gubler和Hoffman（1983）通过改进引导合成法而来的。第一链合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，然后用一段带接头序列的Poly（dG）短核苷酸链作引物合成互补的cDNA链，接头序列可以是适用于PCR扩增的特异序列或用于方便克隆的酶切位点的序列。这一方法目前已经发展成PCR法构建cDNA文库的常用方法。四、双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖。双链cDNA在和载体连接之前，要经过一系列处理，如同聚物加尾、加接头和分级分离。1．同聚物加尾（图8-6）该方法只对质粒有效，尾的长短不一（100dA/dT,20dG/dC）。同聚尾结合的质粒：cDNA杂合分子转化E.coli的效率随宿主不同而不同。2．合成接头和衔接头（图8-7）平端连接的效率低，加尾和加接头主要为了提高连接效率，其中添加带酶切位点的接头最为常用的方法。一种方式是单酶切位点连接策略，其在第一链合成时不引入接头，而直接在第二链上通过平端连接导入接头，当导入的粘端接头已经去磷酸化，则可以分级分离后直接用于连接；当导入的粘端接头带有活性磷酸基团时，所加接头需选择甲基化敏感的酶且加接头之前必须对双链cDNA进行甲基化处理，加上接头后再用该酶进行消化，创造用于连接的粘端。另一种方式是双酶切连接的策略，一般在第一链合成时在cDNA的5'-端引入一稀有酶切位点，如NotⅠ，在双链cDNA平端连接上带去磷酸化粘端的接头，如SalⅠ，然后用NotⅠ酶切创造出另一端的粘端，这样可以与对应双酶切载体连接。同时，双酶切连接可以对插入的cDNA具有定向的作用。3．其他方法3.1mRNA-cDNA杂交体克隆合成第一链后,通过末端转移酶加尾,然后与带dT尾的载体退火，在宿主体内,可除去RNA,代之以DNA。此方法无须合成第二链,且序列完整，但效率低。3.2经典RACEcDNA克隆时常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长cDNA克隆。cDNA克隆中,得到了不完整的片段,可采用此方法获得3'末端和5'末端的序列。工作原理见图8-8、图8-9。筛选文库时一般只能回收一个或几个cDNA克隆，而RACE可产生大量独立克隆。引物GSP1根据已经得到的不完整的cDNA的序列设计。8：5'--RACE图8-9：3'RACE3.3新RACE五、cDNA克隆用的载体（见第三章）。