CE-MS联用技术的新发展及其在中药中的应用

CE-MS联用技术的新发展及其在中药中的应用摘要毛细管电泳-质谱(CE-MS)做为20世纪90年代发展起来的最新联用技术，综合了CE的高效分离能力、广泛的样品适应性和MS的高灵敏度、可提供结构信息等优势,已发展成为一种重要的分离分析手段。本文对近几年来CE-MS联用技术的发展作一简单的介绍，并对CE-MS在中药领域的一些应用进展予以综述。关键词毛细管电泳-质谱联用；中药分析；联用技术；应用毛细管电泳(CE)具有分离效率高、分析速度快、样品适应面宽、试剂和样品消耗量少、分离模式多等特点[1],然而由于CE的进样量少,采用紫外(UV)检测器时又因为光程短而导致检测灵敏度比较低。当利用激光诱导荧光(LIF)检测器检测时,灵敏度得到极大提高,一般可达10-9~10-12mol.L，但是只适用于有荧光性质的物质,对其他物质进行分析往往需要比较复杂的衍生化处理。质谱(MS)法灵检测不仅有较高的灵敏度,同时具有较强的定性能力,能够提供样品的结构信息，是CE的一种理想检测器。因此,自1987年Smith等首次提出CE-MS联用方法以来,CE-MS作为强-强联合的仪器，具有高分离效率和高灵敏度的方法,其应用受到了广泛关注,并在过去的20年得到了迅速发展。本文主要对CE-MS近年在CE-MS接口技术、CE分离模式和CE-MS联用的质谱类型的发展及其在中药方面的运用进行综述。1CE-MS接口技术的研究进展CE-MS联用法是20世纪90年代末期才发展起来的最新联用技术，是利用毛细管电泳的高分辨与质谱的高灵敏度相结合的仪器，是强-强联合的仪器。该联用装置与LC-MS有许多相似之处，一般情况下，能用于LC-MS的质谱仪，只要改变接口，也能用于CE-MS.主要差别是CE的背景电解质的流量（ml·min-1）远小于HPLC流动相的流量（ml·min-1）[2]，因此CE-MS的接口与LC-MS有一定差别。接口技术是实现CE-MS联用的关键所在。CE-MS联用分为在线联用和离线联用。CE-MS离线联用的关键是对已分离样品的有效收集,并不涉及真正意义上的联用接口技术;而且与离线联用相比,CE-MS在线联用具有样品损失少、自动化程度高、分析速度快等优点,其应用要比离线联用广泛得多。CE-MS在线联用需要设计合适的接口,能够将已分离的样品全部转移到质谱仪中,同时实现样品快速高效的离子化，同时接口对技术要求很高。因此,CE-MS在线联用接口技术是研究的重点,目前应用于CE-MS在线联用的离子源包括快原子轰击(FAB)[3]、电喷雾电离(ESI)[4]、大气压化学电离(APCI)[5]、电感耦合等离子体(ICP)[6]、大气压光电离(APPI)[7]等,其中,ESI源应用最为广泛。1.1CE-ESI-MS接口技术电喷雾电离（ESI）接口技术于1984年在MS中提出，溶液在高场中毛细管端以1-10ul/min的流速喷射进入MS检测器。接着，whitehouse等人[8]的LC-ESI-MS接口问世。但是，对于LC-MS的接口都不能直接由CE-MS加以利用，主要原因有两个：一是CE流量小、流速慢（大多为10~100nl/min）,不能满足各种接口对流速的要求（2~10ul/min）；二是由于毛细管端不存在缓冲液中，所以必须解决CE操作中的电接触问题，保证提供分离电流回路。不过基于whitehouse等人的LC-MS接口理论，smith等[9]将CE分离毛细管的出口端作喷射源，首先实现了CE-ESI-MS的在线偶合。电喷雾（ESI）接口作为最早出现的在线联用接口技术，使得被分析物带上多电荷后采用质谱仪可以检测相对分子质量达几万甚至十几万的生物大分子。由于ESI自身的优势以及CE-ESI-MS接口技术的日益趋于成熟,使CE-ESI-MS已成为CE-MS联用技术中占主导地位的方法。CE-ESI-MS接口主要分为鞘液接口和无鞘液接口两种。1.1.1鞘液接口技术鞘液接口技术是最早出现，最早实现商品化的CE-MS接口，基于上面提到的接口问题，其优点在于通过提高样品流速使得喷雾更加稳定,有利于形成稳定的电流回路,同时可改变CE运行缓冲液的组成,使其满足ESI源的检测要求。主要有低流速(low-flow)鞘液接口，多通道的CE-ESI-MS联用鞘液接口。最近,Li等[10]报道了一种将鞘液接口和无鞘液接口相结合的技术。这种设计既可以消除因鞘液造成的分离完整性的下降,又可以消除因无鞘液接口不能改变缓冲液而造成的磷酸根离子的离子抑制作用,综合了鞘液接口和无鞘液接口技术的优点。1.1.2无鞘液接口技术随着科学研究和分析方法对仪器的灵敏度要求越来越高,无鞘液接口技术由于不存在任何稀释效应而逐渐受到研究者的青睐,并在μESI和纳流喷雾离子(nESI)中有不少成功的应用。无鞘液接口技术不能像鞘液接口技术一样依靠稳定的喷雾实现电流回路,因此必须采用一些其他的方法来形成电流回路。2006年,Zamfir等[11]设计的接口是将CE毛细管的末端做成锥形并在其上涂渍一层铜,利用铜涂层形成稳定的电流回路。同年,Fanali等[12]设计了一种加压的液接型接口。液接型接口是无鞘液接口技术中比较特别的一种。与其他无鞘液接口相比,液接型接口可以通过液接液体来改变CE运行缓冲液的组成,使其满足电喷雾离子源的要求。与鞘液接口相比,液接型接口不存在鞘液的稀释作用，但这种接口会存在液体死体积问题。毛细管局部多孔化学刻蚀是一种常用的无死体积的无鞘液接口技术。段继诚等[13]采用此方法设计了新型的纳流无鞘液接口另外,Zhou等[14]的研究发现,改变传统的位于ESI源和进样喷嘴之间的接口不锈钢板方向,可以增大离子传输效率,有助于改善μESI存在的离子传输效率低的问题。根据报道,改变接口不锈钢板方向可以增大信号强度5倍,检出限降低至传统的不锈钢板方向接口的1/7。1.1.3芯片CE-ESI-MS接口技术芯片CE与ESI-MS联用的方法主要分为两类:一类是将ESI源和CE微芯片整合在一起,另一类是把毛细管喷雾器附加在CE微芯片内。后者的应用更为广泛,其优势在于更有利于装置的微型化。2CE-MS分离模式的研究进展CE的一些常用分离模式,如毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动色谱(MEKC)、毛细管电色谱(CEC)等,都在CE-MS中得到了应用,其中CZE应用最为广泛,MEKC、CEC与MS的联用扩大了CE-MS所能分析的样品的范围。实现CE-MS联用面临的主要问题是CE背景缓冲液中的盐、毛细管壁涂层材料或者MEKC中的表面活性剂等会降低被分析物的离子化效率甚至严重污染MS离子源。目前常用的解决方法是采用挥发性缓冲盐或者部分填充技术。此外,非水毛细管电泳(NACE)缓冲液中用到的有机溶剂挥发性好、表面张力低,在与MS的联用中有着很好的应用前景[15]。21世纪初毛细管管电色谱-质谱联用法（CEC-MS）兴起，虽然刚刚起步，但就CEC可以不用含有非挥发性缓冲盐的流动相，仍然具有的高选择性及高分离能力的特点而言，有望解决背景电解质的问题[16]。3CE-MS质谱类型的研究进展在MS方面,几乎各种不同类型质量分析器的质谱仪都可与CE联用,其中三重四极杆质谱(TQ-MS)和离子阱质谱(IT-MS)以其仪器简单、分析速度快的特点应用最为广泛;与之相比,飞行时间质谱(TOF-MS)和傅里叶变换-离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)适用于分析更大的分子,并且具有更高的质量分辨率和准确度,进一步提高了CE-MS的分析能力。4CE-MS在中药中的应用中草药成分复杂,如何对其有效成分进行分析和质量控制一直是研究的难点。CE-MS是LC-MS的补充，在中草药分析中的应用日益广泛。2008年，孙毓庆等[17]综述了CE-MS在中药质量控制中的一些应用,主要是中草药中生物碱的分离检测。沈阳药科大学赵新峰、孙毓庆等[9]用CE-ESI/MS/MS分析了中药材熟地黄、牡丹皮、山茱萸、泽泻及成药六味地黄丸，确定了成药及药材的37种成分。陈军辉等[18]用高效毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱分析黄连中的生物碱，建立了高效毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱联用(HPCE-ESI-TOF/MS)快速定性分析黄连中生物碱类化合物的分析方法.使用未涂层石英毛细管,50mmol/L乙酸铵-0.5%甲醇溶液(用氨水调至pH＝7.2)作为运行缓冲液,分离电压为25kV;鞘液组成为50%甲醇-49.5%水-0.5%乙酸,鞘液流速为4μL/min;质谱选用正离子模式,碰撞电压(Fragmentor)为100V.结果表明,通过各色谱峰紫外光谱和质谱测得精确分子量结果,结合文献,对黄连中7种生物碱进行了鉴定.表明本方法简便、快速,是黄连中生物碱类化合物快速分离、鉴别的有效方法.此外,中草药中毒性成分的分析关系到用药的安全,也是研究的重点,例如,一些中草药中的马兜铃酸具有肾毒性,危害人的健康,陈军辉等[191]建立了CE-MS方法用于中药和生物样品中马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ的快速分析,采用羧甲基壳聚糖涂层的毛细管,可在6min内基线分离两种马兜铃酸;与CE-UV方法相比,CE-MS方法具有更高的灵敏度,LOD为0.05μg/mL,同时MS可得到结构信息,所建立的方法可对血样中的马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ进行分析,为马兜铃酸毒理作用的研究提供了分析技术支持。除了用于中草药,CE-MS也用于其他天然产物活性或毒性成分的分析,如橄榄油中酚类化合物及其衍生物的分离分析[20]、HibiscussabdariffaL.中花青素的分离鉴别[21]、Amanita菌毒性多肽分析[22]等,陈建军等[23]建立了CE-MS方法用于烟草中致癌物亚硝胺类化合物(TSNAs)的分离与定量分析,经采用固相萃取(SPE)对样品处理后,CE-MS成功地应用于TSNAs在兔体内15min后代谢物的分析。通过与CE-UV方法比较,CE-MS方法具有更高的灵敏度,N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)及其代谢物4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶)-1-丁醇(NNAL)3种化合物的LOD为0.1μg/mL,N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱和iso-NNAL的LOD为0.2μg/mL;CE-MS还能够给出化合物的结构信息,具有更高的选择性。5.总结和展望经过20多年的发展,CE-MS已成为重要的分离分析手段,得到广泛的应用。本文简单综述了近年以来CE-MS接口技术的发展及其在天然药物化学领域的一些应用。对于CE-MS未来的发展趋势,主要仍将集中在提高CE的分离能力、新接口技术以及应用研究方面。(1)毛细管涂层材料的发展:毛细管壁对蛋白质、多肽等生物大分子及其他碱性化合物的非特异性吸附严重影响其分离结果。通过对毛细管进行涂层可有目的地减弱非特异性吸附,同时还可控制电渗流(EOF),提高分离效率和重现性。然而,涂层材料流失会造成MS离子源的污染,所以探索稳定的涂层材料将是CE-MS发展的一个方向。(2)通过在线富集或者与其他提取富集技术联用,进一步提高CE-MS的选择性和灵敏度[24]。CE-MS与其他提取富集技术在线联用,可简化基质复杂的生物样品的分析流程,减少样品的损失,提高分析速度。CE一些常用的在线富集方法,如场放大堆积、pH调制堆积、瞬时等速电泳.等,都在CE-MS的联用中得到应用,另外,与SPE微柱在线联用或者毛细管柱上富集等都被用于进一步提高CE-MS的检测灵敏度和选择性。(3)芯片CE与MS联用技术。芯片CE与常规CE相比,体积小、分析路径短、样品谱带展宽效应减弱,分析速度更快,而且通过芯片多通道设计或者芯片并联,更容易实现多维的分离,可以大大提高分析通量,特别是芯片与MS接口技术的发展将大大促进芯片CE-MS联用技术的发展。(4)CE与高分辨MS等新型质谱仪联用。目前,与CE联用的MS主要还是四极杆MS和离子阱MS,高分辨MS如FT-ICR-MS和Q-TOF-MS与CE联用可以进一步提高分析的灵敏度和对化合物结构的分析能力。随着这类质谱仪的应用日益广