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胆囊结石病人胆囊黏膜组织CFTRmRNA表达与胆囊结石形成关系的研究陈锦鹏王志伟*朱铭岩沈洪薰倪启超陈玉泉中文摘要目的：研究胆囊结石患者胆囊黏膜组织CFTRmRNA的表达与胆囊结石形成的关系。方法：用RT-PCR方法测定胆囊黏膜黏膜CFTRmRNA表达。结果：胆囊结石组CFTRmRNA表达显著高于对照组（P=0.002）。结论：胆石症患者CFTRmRNA高表达与胆石的形成有关。关键词：胆石症囊性穿膜传导调节因子RT-PCRTheexpressionofCFTRmRNAofgallbladderwallin100patientswithgallstonesChenjinpeng,Zhumingyan,Wangzhiwei,DepartmentofGeneralsurgery,AffiliatedHospitalofNantongmedicalcollage,Nantong226001Objective:ToinvestigatetheexpressionofCFTRmRNAofgallbladderwallof100patientswithgallstones.Methods:weinvestigatedtheCFTRmRNAexpressionofgallbladderwallof100patientswithgallstonesbyreversetranscriptpolymerasechainreaction(RT-PCR).Results:CFTRmRNAexpressionofgallbladderwallof100patientswithgallstoneswashighersignificantlyinexperimentalgroupthanincontrolgroup(0.493±0.258vs0.382±0.105).Conclusion:ThehighexpressionofCFTRmRNAofgallbladderwallwasassociationtogallstone.[keywords]cholecystitisCFTRRT-PCR囊性穿膜传导调节因子（cysticfibrosistransmembranceconductanceregulator,CFTR）是目前的研究热点之一。2000年10月-2002年3月，我们用RT-PCR分析研究100例胆囊结石患者及50例正常对照组胆囊黏膜CFTRmRNA表达，探讨胆囊结石症患者胆囊组织CFTRmRNA的表达与胆石成因有关系。材料与方法一、临床资料南通医学院附属医院普外科住院行胆囊切除术的胆囊结石患者100例为实验组，其中男47例，女53例，男女性别比为1：1.3，平均年龄为50.35岁；对照组50例，为行上腹部手术的非胆囊结石病患者，其中男26例，女24例，男女性别比为1.08：1，平均年龄为61.1岁。二、标本收集胆囊标本采取,当术中取下胆囊时立即剪下0.5×1.0cm大小全层胆囊黏膜组织2～3块,用无菌生理盐水冲洗三次后装入Eppendorf管,立即置入液氮中,迅速送至实验室,置于-85℃深低温冰箱冷冻保存待测.三、试剂与仪器TRIZOL试剂,为美国Technologies公司产品。逆转录试剂盒Access本课题为江苏省科委资助课题(BJ200053)通信联络人：王志伟南通医学院附属医院普外科226001RT-PCRSystem为美国Promega公司生产。PCR仪GeneAmpPCRSystem2400为美国PERKINGELMER公司产品。四星凝胶图像分析系统为上海四星生物技术公司产品。实验用的刀、剪、镊子、及玻璃制品均经200℃高温2h烘烤处理。Eppendorf管等塑料制品均用DEPC水处理。CFTR及内参β-actin引物按有关文献[1，2]设计，由上海生工生物工程公司合成。目的基因的基因库登录号为XM_004980，全长6136bp，扩增片段全长267bp,内参β-actin扩增片段全长531bp。β-actinSense:5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'Antisense:5'-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3'CFTR：Sense:5'-ACTGGAGCAGGCAAGACTTCA-3'Antisense:5'-CAGTGTGATTCCACCTCTC-3'四、实验方法取新鲜组织约100～120mg，提取总RNA。甲醛变性胶电泳检测其RNA完整性。RT-PCR扩增采用ACCESSRT-PCRSYSTEM,第一链cDNA合成及PCR反应均在同一体系完成。取DEPC水处理过的100μlEppendorf管，依次加入AMV/TFI5×Buffer10μl，dNTPmix1μl，25MmMgSO42μl，AMV逆转录酶1μl，TFIDNA多聚酶1μl，Nuclease-FreeWater21μl，分别加入引物β-actin及CFTR引物各3μl，mRNA模板2μl，总反应体积50μl，加石腊油10μl。反应条件：在48℃×45′、94℃×2′中完成逆转录,经94℃×30′、60℃×1′和68℃×2.5′循环40次，68℃×7′终止反应。2%琼脂糖凝胶85伏特电泳30min后取出,置入0.5μg/ml溴乙锭溶液染色30min后，经图像分析系统作凝胶图像分析，用CFTR与β-actin电泳条带的光密度比值计算出CFTRm-RNA表达的相对量。采用stats6.0计算机辅助统计分析。两组单间因素比较采用t检验。图1CFTR电泳图（1-7标本，M：PCRMarkers）结果实验成功扩增出长267bp目的基因片段（图1），经凝胶图像分析系统分析后t检验发现，胆囊结石组胆囊黏膜CFTRmRNA表达的相对值显著高于对照组。（见表1）表1两组胆囊黏膜CFTRmRNA表达比较（χ±S）指标胆石组对照组tPCFTR0.493±0.2580.382±0.1052.920.002讨论CFTR是ABC（ATP-bindingcassette）蛋白家族的一个成员，其含有两个疏水的结构，两个ATP结合结构和一个细胞内结构[3]。CFTR调节着许多外分泌组织的分泌活动，其基因位于第7对染色体长臂上（7q31），编码1480个氨基酸组成的离子通道蛋白，具有氯离子通道活性。CFTR基因突变将导致外分泌腺的功能紊乱，肺、肝、胆道、胰腺及生殖系统都将受到不同程度的损伤。在胆道系统，CFTR位于胆道上皮细胞膜顶部[4]，起着C-AMP介导的氯离子通道作用，依赖C-AMP来调节细胞的外分泌活动[5]。实验表明，CFTR与胆道上皮黏蛋白的持续合成和分泌具直接作用[6～8]。Nathalie[9]等发现CFTR突变的胆囊纤维性变（CF）患者，其胆道、胆囊受到明显的损害，免疫组化显示胆囊、胆道壁组织中CFTR表达明显增加。Shoda[2]等人发现，肝内胆管结石病人的有结石的胆管组织中CFTRmRNA丰度显著高于无结石的胆管组织。本实验发现，胆囊结石患者胆囊黏膜CFTRmRNA的表达要明显高于对照组(P=0.002)，说明CFTRmRNA表达增高与胆囊结石密切相关。本实验中，我们发现胆囊结石组病人胆囊黏膜CFTRmRNA的表达明显高于对照组，证实了CFTRmRNA的高表达与胆石的形成密切相关。我们推测可能通过以下几种机制促进了胆囊结石的发生，①有研究证实CFTR的增高可影响胆囊的收缩功能。我们在相关的系列研究中也发现，胆囊结石病人胆囊黏膜CFTRmRNA表达增高的同时，胆囊的收缩功能明显下降，表现为胆囊的空腹容积和餐后残余容积均有明显增加，胆囊收缩功能的降低使得胆汁在胆囊的贮留时间明显延长，由于胆囊黏膜对胆汁中水和电解质的重吸收使胆汁浓缩，直接产生成核作用。另一方面，由于胆囊胆汁的贮留，肝内胆汁直接进入十二指肠，肝肠循环加快，单位时间内胆汁酸的重吸收增加，抑制了肝脏合成胆汁酸，胆固醇代谢受影响，使胆汁中胆固醇呈过饱和状态，直接导致胆固醇结石的形成。②研究表明，CFTR的增高与胆道黏膜的蛋白合成和分泌有直接作用[7]。CFTR通过改变细胞内CAMP的浓度来增加黏蛋白的合成。我们在相关的系列研究中也已证实了胆囊结石患者胆汁中黏蛋白的含量明显增加，黏蛋白的增加使胆汁黏稠度增高，具有促进成核的作用。由于胆囊黏膜的重吸收作用，靠近黏膜的水分先被吸收，黏蛋白浓度增高，黏附由于胆汁超浓缩形成的微小核心，使其不易排入肠道，最终发展成为结石。CFTR增高导致胆囊收缩功能下降和黏蛋白分泌的增加，二者相互作用，促进了结石的形成。CFTR与胆囊结石形成相关的研究报告并不多，对胆汁其他成分的代谢有无影响，有待更加深入的研究。参考文献1.Funaki-NO;Tanaka-J;Ohshio-G;Onodera-H;Maetani-S;Imamura-MCytokeratin20mRNAinperipheralvenousbloodofcolorectalcarcinomapatients.Br-J-Cancer.1998Apr;77(8):1327-13322.JunichiShoda,Masahitokano,Toruasano,etal.Secretorylow-molechlar-weightphospholipasesA2andtheirspecificreceptorinbileductsofpatientswithintrahepaticcalculi:Factorsofchronicproliferativecholangitis.Hepatology,1999;29(4):1026-1036.3.RandakC,WelshMJ.AnintrinsicadenylatekinaseactivityregulatesgatingoftheABCtransporterCFTR.Cell.2003Dec26;115(7):837-50.4.Dray-CharierN.PaulA,VeissiereD,MergeyM,ScoazezJ-Y,CapeauJ,Brahimi-HornC,etal.Expressionofcysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorinhumangallbladderepithelialcells.LabInvest1995;73:828-836.5.BecqF,CFTRandtransepithelialionictransportabnormalitiesincysticfibrosis.ArchPediatr.2003Sep;10Suppl2:325s-332s.6.ForstnerG,ZhangY,McCoolD,ForstnerJ.MucinsecretionbyT84AmJphysiol1993;264:G1096-1102.7.WalkerJ,JijonHB,ChurchillT,KulkaM,MadsenKL.ActivationofAMP-activatedproteinkinasereducescAMP-mediatedepithelialchloridesecretion.AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol.2003Nov;285(5):G850-60.Epub2003Jul17.8.KuverR,RameshN,LauS,SavardC,LeeSP.OsborneWRA.ConstitutivemucinsecretionlinkedtoCFTRexpression.BiochemBiophysResCommun1994;203:1457-1462.9.NathalieDray-CHArier,AnnickPaul,Jean-YvesscoA2ecetal.ExpressionofDeltaF508cysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorproteinandrelatedchlor