CRISPR操作系统(原理)

一图看破CRISPR操作系统！近日，Cell发表了一篇名为“SnapShot:CRISPR-RNA-GuidedAdaptiveImmuneSystems”的精华文章，用一张图，就全解析了CRISPR系统的“中心法则”。今天就让麦子带大家分解此图，真正掌握时下这个可以对人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物等细胞内的基因进行精确编辑的热门技术之精髓：细菌和古细菌已经根据CRISPR（规律成簇的间隔短回文重复，Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）位点和多样化CRISPR相关（CRISPR-associated，Cas）基因，进化出了复杂的CRISPR适应性免疫系统。CRISPR系统可以分为三种类型（I-III）及至少11种不同的亚型（I-A~I-F，II-A~II-C，III-A~III-B）。但是所有的CRISPR-Cas免疫系统都是通过主要的三个阶段来行使功能：外来DNA的采集CRISPRRNA的生物合成靶向干扰第一阶段：外来DNA的采集（ForeignDNAAcquisition）宿主通过Cas蛋白来识别外源核苷酸，入侵细菌的短片段DNA称为protospacers，它们作为间隔区序列插入到了宿主的CRISPR位点。在I和II型系统中，protospacers选择自入侵DNA旁出现PAM的区域（PAM：protospaceradjacentmotif，对于CRISPR结合至关重要）。一般protospacers通过包含Cas1、Cas2和游离3'-羟基等元件的机制连接在CRISPR位点的前导区(Leader)。Protospacer的整合也伴随着末端重新序列复制，这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。第二阶段：CRISPRRNA的生物合成（crRNABiogenesis）CRISPRRNA的生物合成从转录开始，接下来是初级转录产物pre-crRNA加工生成一类短的CRISPR衍生RNAs（crRNAs），每一个都包含与之前遇到的外源DNA（Spacer序列）对应的互补序列。crRNA导向序列的两侧是相邻重复序列区域。在I型和III型系统中，初始CRISPR转录产物会被CRISPR特异性核酸内切酶（Cas6或Cas5d）在重复序列位点内切割。在许多I型系统中，重复序列是回文结构的，Cas6可以稳定连接在crRNA3'端茎环上。而在III型系统中，Cas6短暂与CRISPRRNA连接，crRNA的3'端会被未知的核酸酶进一步处理。CRISPRRNA的加工在II型系统中依赖于包含一个与重复序列互补序列的反式作用crRNA(tracrRNA)。这些双链的区域在Cas9存在时可以被RNaseIII加工，靶向干扰需要tracrRNA和crRNA的同时存在。II型系统中的这两个RNAs可以融合成一个sgRNA，目前，II型系统是我们研究的“火力”较为集中的系统，而Cas9已经变成了在多种细胞类型和组织中靶向基因编辑的强大工具。第三阶段：靶向干扰（TargetInterference）成熟的crRNAs指导Cas蛋白到互补靶标，靶序列由特异性的Cas核酸酶降解，但不同的CRISPR系统降解机制存在差异：I型和II型系统都可以靶向包含PAM和protospacer互补序列的dsDNA底物。在II型系统中，靶标的降解是通过单一的蛋白Cas9和两个RNAs来实现的，而在I型系统中，则依赖于包含多个亚型的复合物，可以结合dsDNA并招募Cas3，Cas3是一个反式作用的核酸酶，经常融合到依赖于ATP的解旋酶上。类似于I型系统，III型系统也同样依赖于探测目标的多亚基复合物，这些复合物展示出了内源性核酸酶活性，依赖于转录方式降解互补的RNA、靶向DNA，不过III型系统不依赖于PAM进行靶标位点的识别，而是通过碱基互补配对，导向序列延伸至crRNA信号5'handle的核苷酸进行识别（CRISPR位点包含与导向序列，5'handle互补的序列），并阻止靶向裂解。关闭颈环在I型系统中，复合物靶向结合会导致Cas3介导的靶向降解（直接干扰）或最初采集，这其中涉及crRNA导向募集Cas3、Cas1和Cas2到外源DNA处，引起新一轮的快速采集。II型系统中虽然未观察到最初采集，但Cas9是protospacer正确筛选的必要元件，这表明在靶向干扰与外源DNA采集之间存在一种功能性联系。近期，多种可以产生anti-CRISPRs蛋白的病毒编码基因已经证明了可以干扰CRISPR的不同阶段，这将颠覆CRISPRs系统。衍生阅读：anti-CRISPRs在9月的Nature文章：“MultiplemechanismsforCRISPR–Casinhibitionbyanti-CRISPRproteins”中，研究人员确定了三种anti-CRISPR蛋白：AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能机制，验证了它们通过不同的机制抑制CRISPR–Cas的活性。AcrF1、AcrF2可以通过与不同的蛋白质亚基互作，利用了空间或非空间抑制模式来阻断了CRISPR–Cas复合物的DNA结合活性，AcrF3通过结合Cas3解螺旋酶-核酸酶，阻止其招募到结合DNA的CRISPR–Cas复合物上来起作用。这是首次证实了蛋白质相互作用可以调控CRISPR–Cas的活性。