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基因组编辑新技术：CRISPR–CasRNA介导的、基于成簇的规律间隔的短回文重复序列和Cas蛋白的DNA核酸内切酶尽管一些CRISPR–Cas系统需要多种蛋白才能发挥功能，在许多细菌中发现的II型系统却只需利用一种内切核酸酶Cas9。该酶与导向RNA协同作用定位在PAMs保守序列限定的位点，裂解入侵DNA。为了形成功能性的DNA靶向复合物，Cas9需要两种不同的RNA转录物，crRNA（CRISPRRNA）和tracrRNA（CRISPRRNA）。新的研究论文表明，RNA导向Cas9可以在多种细胞和生物体中发挥功能，在特异位点裂解完整基因组。这一点使得它具有基因组编辑的潜能。当借助于同源重组或是非同源末端连接，这些标准的细胞修复机制修复双链断裂时，可以此修改修复位点的序列，或插入新的遗传信息。此外，麻省总医院的研究人员证实将Cas9编码mRNA和适当的导向RNAs注入到单细胞期胚胎中，在所有测试胚胎中导致了10个位点中的8个发生了高频率(24–59%)的靶向性插入和删除。这些研究结果表明，RNA导向Cas9可能能够用于操纵其他的多细胞生物，包括哺乳动物和植物。该技术另一个最让人感到兴奋的潜在应用是，为生成人类疾病动物模型提供了一种简单的方法。利用RNA可编程Cas9进行基因组操作，有望广泛应用于合成生物学、直接和多路干扰基因网络，体内外靶向性基因治疗。下一个挑战将是分析和解决可能出现的脱靶效应，提高系统效率和特异性，扩大应用到其他生物体。有了RNA导向Cas9酶，细菌现在为我们提供了重新基因组序列信息的一个通用工具，其具有在生物技术和医学中改造基因组工程景观的潜力。CRISPR（clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat）即成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短重复序列的位点，这种位点在细菌和古细菌（archaea）胞内起到了一种获得性免疫的作用。CRISPR系统主要依赖crRNA和tracrRNA来对外源DNA进行序列特异性降解。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，其中在2型系统（typeIIsystems）中依赖的是Cas9蛋白。在RNA的介导下，Cas9蛋白能够对crRNA–tracrRNA识别的靶序列进行切割。crRNA：CRISPRRNA能够与tracrRNA配对，形成双链RNA结构，这种双链RNA分子能够介导Cas9核酸内切酶对与双链RNA分子互补结合的DNA序列进行切割。HDR：同源重组修复，DSB出现之后，细胞会启动这种修复机制，以同源链为模板，对DSB进行修复。由于这种修复作用是以同源链为模板，而且还有位点特异性的核酸酶（site-specificnuclease）参与，所以其保真度非常高。利用HDR可以插入一个或者多个基因，也可以进行单碱基替换。NHEJ：非同源末端连接修复机制是另外一种DSB修复机制，通过这种修复可以将断裂的DSB末端直接连接起来。由于在这种修复过程中不会用到同源模板链，所以在断裂处容易出现小的插入或者缺失突变，常常会导致移码突变，使基因的功能遭到破坏。tracrRNA：反式激活嵌合RNA（trans-activatingchimericRNA），这是一种非编码RNA，能够促进crRNA的形成，也是Cas9蛋白发挥RNA介导的DNA切割作用必不可少的辅助因子。CRISPR系统能够为细菌提供一种获得性免疫保护机制，通过这套RNA介导的DNA切割机制使细菌免受外源DNA的侵扰。在2型CRISPR/Cas系统里，短片段的外源DNA分子（也可以称之做间隔分子）被整合到CRISPR基因组位点内，进行转录，进而被处理成短CRISPRRNA，即所谓的crRNA分子。这些crRNA分子与反式激活的crRNA，即tracrRNA结合，介导了序列特异性的切割作用，最后在Cas蛋白的作用下使外源的“致病”DNA分子沉默。最近的研究表明，Cas9蛋白的靶向识别作用需要依靠crRNA里的一段“种子序列”，以及crRNA结合区域上游的保守的含有双核苷酸（dinucleotide-containing）的间隔前临近基序序列（protospaceradjacentmotifsequence,PAM）的帮助。所以从理论上来说，这套CRISPR/Cas系统几乎可以在crRNA的介导下对任意的DNA序列进行切割，关键就在于设计出合适的crRNA序列。更加重要的是，这套CRISPR/Cas系统已经被证实能够在人体细胞内发挥作用，只需要在人体细胞内转入能够表达Cas9核酸内切酶的质粒和相应的crRNA分子就够了。已经有人使用这套RNA介导的DNA切割机制成功地对iPS细胞进行了试验，证明这套技术对这种细胞具有基因破坏作用和定向整合等多种基因组编辑修饰作用。Cas9蛋白也可以被替换成切口酶，进而启动另外一种DNA修复操控机制。除了能够应用于人体细胞之外，这套CRISPR/Cas基因组编辑技术也可以应用于斑马鱼和细菌等其它物种的细胞，不过还需要开展更进一步的研究来充分认识这套系统的真正应用价值，比如是否存在脱靶效应等。另外，我们也不清楚这套系统是否就是唯一的单位点特异性的基因组识别系统。结论及未来的发展方向CRISPR/Cas系统都是非常有力的转化工具，对生物学研究和个性化医疗（personalizedmedicine）都能够起到革命性的影响和促进作用。实际上，这些新兴的技术极大地拓展了我们对模式生物的处置和研究能力，也为治疗遗传性疾病，纠正遗传错误提供了一种平台。其中最主要的问题就是每一种技术平台的特异性问题。在不久的将来，能够全面识别脱靶位点的高通量筛查技术可以帮助我们更清楚地认识每一种技术平台的特异性问题。其它问题还包括用哪种方法往细胞或者生物体内输送核酸酶更合适等。虽然CRISPR/Cas系统在遗传改造方面表现出了极大的潜力，同时也展现出了极强的灵活性，但是这套系统对PAM序列的独特需求也在一定程度上限制了它的应用。对Cas9蛋白的定向进化工作可能能够帮助CRISPR/Cas系统最终“抛弃”PAM序列，同时也可以得到酶切效率更高的Cas9蛋白。当然，还需要开展其它体内和体外研究，来评价CRISPR/Cas系统的特异性和毒性。目前该技术成功应用于人类细胞斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点突变基因定点敲入两位点同时突变和小片段的缺失由于其突变效率高制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具.此系统增强发酵菌株对噬菌体的防御能力也被用于菌株的分类，以及防止一些携带致病或是抗性基因的质粒的扩散在基因治疗中的应用