搜索
CTAB法提取细菌TotalDNA原理CTAB法原理CTAB(HexadecyltrimethyAmmoniumBromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。阳离子表面活性剂，呈白色或浅黄色结晶体至粉末状。易溶于异丙醇，可溶于水，熔于热水、乙醇、三氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于醚和苯。在高离子强度的溶液中(0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB提取缓冲液的经典配方：Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解于液相；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。1.用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点:有效变性蛋白质；抑制了DNase的降解作用。缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA；不能完全抑制RNase的活性。2.氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）3.用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡；降低表面张力，从而减少气泡产生；另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。4.用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc（20mmol/L？）Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。不同生物DNA的提取方法不尽相同，但各种提取方法也有很多相通之处，可以相互借鉴。在DNA提取过程中应做到：1、根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2、尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。核酸的提取关键是去除蛋白质，通常情况下，先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提，在单价阳离子存在下，核酸在乙醇中形成沉淀。真核生物中的染色体DNA与碱性蛋白（组蛋白）结合，形成核蛋白（DNA），存在于核内。DNA在低浓度NaCl中，随NaCl浓度升高，溶解度降低，但升高到0.14mol/L时，DNA溶解度又随着浓度升高而增大，至1mol/L氯化钠中的溶解度比纯水高2倍。DNA溶于浓盐溶液（如1mol/L的NaCl），但不溶于生理盐溶液（0.14mol/L的NaCl）。RNA在0.14mol/L的NaCl中溶解度相当大，因此可以以0.14mol/L的NaCl把DNA和RNA分开。真核生物中，DNA总是与缠绕的组蛋白同时存在，而原核生物的DNA却是单独存在的。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。真核生物DNA提取先将细胞破壁，用浓盐溶液提取，再稀释到0.14mol/L的盐溶液，使DNP沉淀出来；再溶解沉淀多次以纯化；用苯酚多次抽提，去除蛋白。用水饱和的苯酚与DNP一起振荡、离心，不溶性的变性蛋白在中间界面，DNA溶于上层，部分变性蛋白溶于苯酚。将含DNA的水相，在盐存在的条件下，用乙醇等将DNA沉淀出来。用乙醚或乙醇洗DNA[1]。微生物DNA提取常规的微生物DNA提取多是根据某种微生物的具体特点选择合适的方法[3]。对真菌DNA的提取关键是破碎细胞，通常采取酶解破壁法或物理破壁法（以液氮冷冻处理增加细胞壁脆性）。细胞的破碎方法有三种：①物理破壁法：机械方法（超声波处理法、研磨法、匀浆法）；以液氮冷冻处理增加细胞壁脆性；②化学试剂法：用SDS处理细胞；③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶