CTC细胞的分离与检测

CTC细胞的分离与检测CTC富集通常包括基于CTC的不同特性，包括物理特性(大小、密度、电荷)和生物性质(表面蛋白表达和浸润能力)。物理性能的优势在于不使用标记物来分离CTC。基于物理特性的方法包括密度梯度离心分离；特殊滤器筛选，ISET，或立体微孔过滤器；不同大小带标签的生物芯片；微流体结合多孔流分离(MOFF)和介电泳细胞分离(DEP)技术。生物特性主要用于免疫抗体与肿瘤相关抗原(阳性选择)或白细胞抗原CD45(阴性选择)。免疫磁珠靶向抗原的抗体耦合磁珠，随后抗体抗原混合物通过磁场分离。阳性选择通常是进行抗体的上皮细胞粘附分子(EpCAM)，以及随后CTC的免疫荧光检测。在过去几年，FDA认可CellSearch系统的EpCAM．based技术获得了相当大的关注，是所有新CTC检测方法的“黄金标准”。目前，有一个专注于微流体(芯片)设备的开发，它可以处理非常少的血液量。微流体平台称为CTC芯片，是由数组EpCAM抗体所覆盖。但是缺点是价格昂贵，不适用于临床推广。一．主要分离技术1．膜滤过分离肿瘤细胞技术(Isolationbysi‘zeofepithelialtumorcells，ISET)这一技术是基于细胞大小，通过8um孔径滤过膜过滤，使较小的淋巴细胞和中性粒细胞通过，将体积较大的CTC细胞阻留在膜上，从而保持了细胞的活性和完整性，以利于后续的检测技术。该方法经济简便、敏感度高，可以有效避免多步骤操作引起的细胞损伤和丢失，但是有研究发现不是所有肿瘤细胞都大于8um，因此直径小于8um或者有溶解的细胞会被滤过而无法收集。2.密度梯度离心法(densitygradientcentrifuge)密度梯度离心法是利用配制的分离液密度将不同密度的细胞区分在不同区域。将外周血平铺于分离介质上层，离心作用加速密度大于分离液的细胞沉降，而密度小于分离液的细胞则聚集于分离液面上层，从而达到分离效果。常用的分离介质密度为1．0779．mL～红细胞、粒细胞密度比其大，离心后会沉于管底；淋巴细胞和单核细胞密度小于或等于分离介质，离心后会漂浮于分离介质上层或悬浮于介质中，肿瘤细胞主要也是留存于单核细胞富集层。有时候，肿瘤细胞也会迁移入血浆成分，于是产生了新的改进技术OncoQuick，即在梯度离心介质上安置一层多空膜屏障，这样可以在离心前延滞血液样本中的循环肿瘤细胞扩散，减少了肿瘤细胞的丢失。但是，这样得到的循环肿瘤细胞同大量白细胞和单核细胞混在一起，降低了后期鉴别CTC的效率。3免疫磁珠技术(immunomagneticbead，IMB)IMB最具代表性的就是唯一被FDA批准上市的CellSearchTMSystem(Veridex)，针对上皮抗原EpCAM，利用免疫纳米磁颗粒包被抗EpCAM(上皮细胞粘附因子)的特异性抗体，通过抗原抗体反应形成“细胞一抗原一抗体一磁珠”复合体。尽管CellSearch具有较高的富集效率和回收率，但是有些非恶性来源的上皮细胞也会表达EpCAM[27]，并且有些肿瘤细胞的EpCAM表达缺失，其结果有一定的假阳性和假阴性。MACSSystem技术基于MACS微珠、MACS分选柱和MACS分选器。MACS微珠是直径约为50nm的超顺化磁性颗粒，均由可降解生物材质构成，因而分选后无需解离也不会改变标记细胞的结构功能，不会影响后续实验结果。其优势在于①微珠作载体偶联特定抗原，于细胞表面抗原结合，识别目的细胞；②微珠具有磁性，在外在磁场作用下具有磁性吸附，而失去外加磁力后磁性消失，从而将目的细胞分离出来：具有敏感性高，特异性高，效率高的优点。本研究将首次采用OptiPrep法分离外周血CTC，并尝试结合MACS体系富集循环肿细胞，旨在最大化的去除外周血中的红细胞和白细胞，提高收集液中循环肿瘤细胞的纯度，便于后期的鉴定识别。二.循环肿瘤细胞检测方法简介CTC在识别方面的问题主要是通过细胞的形态、免疫表型、染色体异常和癌基因扩增等综合鉴定。免疫细胞化学在早期较为普遍和直接，其基本原理利用抗原抗体结合反应，将单克隆抗体与肿瘤细胞特异地表面抗原结合，并通过酶与底物显色来标记肿瘤细胞。后来随着免疫荧光技术的出现，使用荧光基团标记抗体识别目标抗原细胞，利用荧光显微镜观察荧光所在细胞的方法逐渐广泛应用于科学研究以及临床诊断。1．免疫荧光技术(Immunofluorescencetechnique，IF)免疫荧光实验的主要步骤包括细胞固定及透化、封闭、抗体孵育及荧光检测等。固定和透化主要是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和步骤对于获得好的结果是非常关键的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与ELISA或WesternBlot中是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到的抗体是带有荧光基团，必须避光操作以避免荧光猝灭，此外抗体浓度的选择可能也很关键。识别肿瘤细胞荧光染色有细胞角蛋白CK8、CKl8、CKl9，常见的白细胞抗原CD45和核染料(DAPI)。CellSearch通过多色荧光显微镜图像分析，CTC被定义为CK+／CD45-／DAPI+细胞。细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)是一种常见的肿瘤免疫组织化学标记物，主要分布于上皮细胞，为细胞骨架的蛋白组分，维持了上皮组织的完整性和连续性，与己知的20多种细胞角蛋白具有极高的保守性和组织分化特异性，与上皮细胞的增殖分化密切相关。CD45分子在所有白细胞上均表达，称为白细胞共同抗原(1eukocytecommonantigen，LCA)，在肿瘤细胞上均不表达。然而，大量研究证明不是所有CTC都对应以上表达，肝细胞癌中的大部分患者无法检测出CK阳性，同时有关CTC信号通路的研究中发现乳腺癌的CTC能共表达p-FAK、p-P13K和HER2等蛋白，实际上，现有的抗体没有一个是能100％具有肿瘤特异性的，从而需要我们进一步研究各个癌种的肿瘤细胞特异表达抗体。2原位荧光杂交(Flourescenceinsituhybridization)原位荧光杂交技术是在20世纪末放射性原位杂交技术基础上改良的一种非放射性分子细胞技术，其原理是将修饰过的DNA探针与偶联有荧光素分子的单克隆抗体特异性结合，再将其原位杂交到染色体或DNA上来检测目标序列的定性、定位。定量分析。一般有直接法和间接法两种方式，直接标记的探针可简单冲洗后镜检，间接法则能进行多步骤信号放大，更为灵敏。FISH信号检测常用于荧光显微镜，用不同的激光光谱和吸收光谱识别标记探针，更为精确的数字成像技术和共聚焦显微技术能更好地获取FISH信号。随着分子生物学的发展，越来越多的探针种类出现，研发各种染色体的各色荧光探针也成为可能，今后可依据研究领域的条件合成相应的探针标记目的片段从而快速识别目的细胞，加深加快人类在肿瘤学诊断方面的进展。本研究应用细胞免疫荧光结合原位荧光杂交技术检测CTC，很好的弥补了单独荧光染色筛选CTC易于遗漏发生EMT的肿瘤细胞，利用多倍染色体异常的荧光结果，捕捉逃脱免疫荧光识别的细胞，有效预防由于技术造成的漏检、错检，同时增加的防火墙措施能避免假阳性、假阴性的渗入，提高真实CTC的检出率。