cytoscanassay中文手册

CytoScanAssay中文手册gDNA≥50ng/μL关于振荡：Mix：高速振荡3次，每次1秒Reagents：3次，每次1秒酶：快速振荡1秒关于离心：板：除片段化步骤要求4℃外，其余均室温，2000rpm离心1分钟Reagents和酶：离心3秒关于酶：以下步骤用到的所有酶均到用时才能从冰箱拿出，用完立即放回-20℃Stage1:消化1.将gDNA高速振荡3次，每次1秒混匀，2000rpm离心1分钟。2.10×NspIBuffer和100×BSA室温融化，振荡、离心，冰上放置。3.NspIenzyme放于-20℃，用时才能拿出来。4.PCR仪要先预热。5.阳性对照管(+)加5μLGenomicDNA，阴性对照管(-)加5μLlowEDTATE.6.配DigestionMasterMix。7.将Mix振荡混匀并离心。8.将Mix分管加至模板中。9.将PCR板高速振荡5次，每次1秒；2000rpm离心1min。10.按上图右侧的程序运行。Stage2：连接1．预热PCR仪，将板放于室温。2．10×T4DNALigaseBuffer(约20min)和50μMAdaptor,NspI室温融化，振荡混匀，buffer变清澈，离心，冰上放置。3．消化后的模板2000rpm离心1min，冰上放置。4．配LigationMasterMix.5．Mix高速振荡3次，每次1秒；离心3秒。6．将连接Mix分至各消化管。7．将PCR板高速振荡5次，每次1秒；2000rpm离心1min。8．按上图右侧的程序运行。Stage3A：PCR1.连接产物盖紧盖口，2000rpm离心1min。2.稀释连接产物。3.盖紧盖口，高速振荡5次，2000rpm离心1min，冰上放置。4.稀释后的PCR产物每个模板分成4管，每管10μL。如下图5.PCR仪预热。6.10×TITANIUMTaqPCRBuffer,dNTPMixture,PCRPrimer002室温融化，混匀并离心，立即置于冰上。GC-MeltReagent和AffymetrixNuclease-Freewater置于冰上。7.配mastermix。8.高速振荡3次，每次1秒。9.将mastermix分装至各管。10.高速振荡5次，每次1秒。重复振荡一次，2000rpm离心1min。11.按上图右侧的程序运行。此步PCR一定要用银质板或金包银板的PCR仪。Stage3B：PCR产物验证1.取0.2mL的PCR管，各加入5μL的Affymetrix®Nuclease-Freewater和2μL的USB5×RapidRun™LoadingDye。2.从第一排的PCR产物中各抽取3μL加入至上一步的混合液中，得到10μL的产物mix，振荡混匀并离心。3.各取8μL产物mix和5μLDNAmarker点入2%的琼脂糖凝胶中，5V/cm跑胶45min。样本和阳性对照的产物约在150bp~2000bp，阴性对照无条带。Stage4：PCR产物纯化1.将同一样本的4管PCR产物移至同一个1.5mL的离心管中，从此步开始，阴性对照便不必再往下做。2.彻底上下颠倒PurificationBeads至溶液呈均一状。3.每管加入720μLPurificationBeads，盖紧管盖，上下颠倒10次混匀，室温放置10min。4.最大转速（16100rcf）离心（管盖连接处朝向外侧）3min。5.取出管子放在磁力架上。待磁珠富集后，不扰乱磁珠的情况下，小心抽弃上清液。6.每管各加1.0mLPurificationWashBuffer。盖紧管盖，最大速度涡旋振荡2min。7.重复步骤4和5。8.16100rcf离心30s（管盖连接处朝向外侧），重新放在磁力架上。9.用小枪头将管底的PurificationWashBuffer吸净，从磁力架上拿下管子，不盖管盖，使残余的Buffer完全挥发，室温放置10min。10.每管加52μL的ElutionBuffer，直接滴在磁珠上。11.盖紧管盖，最大速度涡旋振荡10min使磁珠重新悬浮混匀。若磁珠尚未完全重悬，轻弹管子，并继续振荡2min。12.16100rcf离心3min（管盖连接处朝向外侧），于磁力架上放置10min。13.待磁珠完全贴于管底一侧，小心抽取47μL洗脱后的模板至新管。14.盖紧管盖，最大速度振荡1s，2000rpm离心1min。Stage5：定量Nanodrop1.在新PCR管中各加入18μLAffymetrix®Nuclease-Freewater，加入2μL纯化产物。2.盖紧管盖，振荡，离心。3.用Affymetrix®Nuclease-Freewater作空白对照，取1μL稀释后的模板测定其在260,280和320nm处的吸光值。4.计算未稀释模板的浓度μg/μL：(ng/μL的浓度×10)÷1000。7个及其以上模板的纯化后浓度需≥3.0μg/μL，不得＜2.5μg/μL；OD260/OD280的比值需在1.8和2.0之间；OD320的值需非常接近于0(＜0.1)。Stage6A：片段化1.开始做片段化前先将板放至冰上冷却到4℃。2.PCR仪提前预热。3.纯化产物从冰箱拿出解冻，振荡离心，置于冰上预冷10min。4.将用到的试剂（除FragmentationReagent直到用时才从-20℃拿出外）放于冰上。配FragmentationMasterMix。5.将Mix高速振荡3次，每次1秒。6.每管模板加入10μLFragmentationMasterMix。7.将板用粘附膜贴牢，高速振荡5次，每次1秒。8.预冷的离心机中2000rpm离心1min。9.将板放入PCR仪，按上面右侧图的程序运行。Stage6B：片段化产物验证1.抽取4μL片段化产物至新的排管中并标记。2.加28μLAffymetrix®Nuclease-Freewater。盖紧管盖，振荡，离心。3.取出8μL，加2μL的USB5XRapidRun™LoadingDye，盖紧管盖，振荡，离心。4.在4%的TBE胶中点入8μL样本稀释液，旁边点入2μLTrackItTM25bpDNALadder。5V/cm电压跑胶45min。理想的凝胶图片如下图。片段化区域约在25~125bp。Stage7：标记1.将5×TdTBuffer和30mMDNALabelingReagent2.配LabelingMasterMix。3.振荡混匀并离心。4.每个模板加入19.5μLLabelingMasterMix。5.用粘附膜将板封好。高速振荡5次，每次1秒，2000rpm离心1min。6.放入PCR仪，按上面右侧图所示的程序运行。Stage8：杂交1.将芯片从冰箱拿出，平衡至室温。2.杂交炉设置成50℃旋转预热1h。3.在AffymetrixGeneChipCommandConsole(AGCC)中用手持红外扫描设备扫描芯片条形码，注册样品信息，生成样品对应芯片ARR文件4.取一个15mL的管子，在冰上配HybridizationMasterMix。5.将Mix高速振荡3次，每次3秒混匀。离心。6.每个标记后的模板加入190μL的HybridizationMasterMix。7.将板封好，高速振荡5次，每次1秒。重复振荡一次。2000rpm离心1min。8.将板放进PCR仪，按下图的杂交程序运行。9.程序运行结束后，使模板在49℃温育至少1min。10.PCR板保持在PCR仪中，抽取200μL杂交液打入芯片中。每次实验最多操作8张芯片。11.擦净隔膜四周的液体，用Tough-Spots®贴上隔膜，压紧。12.立即将芯片放入杂交炉，每次4个。13.50℃下60rpm杂交16~18个小时。Stage9：洗脱，染色，扫描1.把芯片洗涤液washA、washB和去离子水放在洗涤站的相应位置，然后运行AGCCFlutionsControl软件进行初始化；2.初始化结束后，在3个无核酸1.5ml离心管中分别加入500mlstainCocktail1、500mlstaincocktail2和800mlarrayholdingbuffer，然后放在洗脱站的1、2、3位置上，然后把杂交好的芯片从杂交炉直接取出插入洗脱站的槽中；3.在AGCCflutionControl软件的洗脱站Barcode中扫描芯片条形码和在ProbeArrayType中选择相应的芯片类型(CytoScan750K选择CytoScan750K;CytoScanHD选择CytoScanHD)，然后点击运行，大约洗涤2h；4.洗脱结束后，把芯片放在affymetrix的扫描仪中，然后点击affymetrixLauncher中的AGCCScanControl，点击工具栏中的Star进行芯片扫描生成数据。