DDRT-PCR技术研究进展

DDRT-PCR技术及应用的研究进展前言•基因在不同组织细胞的不同生长阶段的选择性表达决定了生物的整个生命过程——个体的生长、发育、细胞周期的调控、衰老及细胞的程序性死亡等。因此分离、鉴定差异表达的基因，研究基因转录对了解生命过程的机理、发现具有特殊功能的表达产物有着重要的意义。DDRT—PCR•早期，从mRNA转录水平筛选差异表达基因的方法是差别筛选技术和扣除杂交法，但二者存在灵敏度低、工作量大、周期长及步骤繁琐的问题。•哈佛大学医学院Liang和Struss博士发明了mRNA差异显示技术，即DDRT—PCR(differ—entialdisplayofmRNAbyPCR)。••1994年，ErricHaay等将这种方法正式命名为差异显示反转录聚合酶链式反应(mRNADifferentialDisplayPCR)，简称DDRT—PCRmRNA差异显示技术的基本原理及实验步骤•1.1mRNA差异显示技术的基本原理•首先，用3’端锚定引物(AnchorPrimer)(dT)VN作为反转录引物反转录细胞总mRNA，合成第一链cDNA；•然后，在用放射性同位素标记的dNTP存在的情况下，用随机引物(ArbitraryPrimer)和与反转录引物相同的锚定引用进行PCR，随机扩增cDNA片段；•将PCR产物在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，通过放射自显影展示并回收多态cDNA片段(即EST)；••将差异带二次PCR扩增并通过Northern杂交来验证、克隆、测序差异cDNA片段。•将所得片段用BLAST与Gen．Bank数据库内的已知序列做比较，确定片段是否是新序列(基因)。•2mRNA差异显示技术的优点和缺点•1优点•周期短，操作简便，省去了cDNA克隆和随后的克隆筛选工作，比递减杂交要迅速；•可同时比较2个以上时空特异性及物种特异性表达基因；•灵敏度高，所需RNA的量少，该法用PCR扩增，每做100个反应只需1IxgmRNA，而递减杂交则需50Ixg；•另外，这种方法的重现性好，在相同条件下重复率可达90％～95％，大大提高了试验结果的可靠性。2缺点•扩增片段短、假阳性高、检测全部mRNA工作量大、基因的克隆受mRNA表达的时效性影响等。而最大的问题还是假阳性太高。据研究，假阳性高达70%•所谓假阳性指克隆的DNA片段用Northern杂交时，没有阳性信号3DD-PCR中的主要问题及解决办法•内部因素：试剂、酶的质量，引物的类型和纯度，RNA的完整性、浓度和纯度等•外部因素：试验设计、适当的内部控制、回收带的标准、反应体系的建立、PCR管的类型及研究者操作的熟练程度等。产生假阳性的原因分析3.2改进DD-PCR方法•(1)用无RNA酶的DNA酶处理总RNA，防止DNA污染。(2)使用Tag酶时，批号应相同，不要经常调换。(3)PCR循环次数减至30次，提高退火温度，减少非特异性条带。(4)把从测序胶上切下来的条带纯化后分成两部分，一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆。(5)改变引物长度，如有的在3′端锚定引物和5′端各加上10个碱基，带上EcoRI双酶切位点，如此可显著提高重复性。3.4克隆差异片段小的解决方法•差异显示得到的片段较小，不能代表真正差异表达的基因。为了得到全长的基因，•传统方法是采用cDNA探针从cDNA文库中筛选，比较复杂。•目前,人们多采用Lauren等创造的mRNA5′端逐渐步移技术，以步移法获取的片段大小多在1～1.5kb之间。•另外还有一种叫RACE(cDNA末端快速扩增)的方法，也比较快速，简便。4引物的改进••起初Liang等设计的引物采用了12种锚定寡聚脱氧嘧啶核苷酸引物oligo(dT)12MN和20种不同的随机引物，•缺点：不仅费时费力，由于随机引物长度短导致结果代表性差，而且得到的扩增片段也较小，所以差异条带易呈现假阳性结果。•Ito等将原本有两个固定碱基的3’端锚定引物变为只有一个固定碱基，使原来l2种引物减至3种(oligodT12A，oligodT12C，oligodT12G)，•优点：减少了每个mRNA样品对反转录反应种类的需要，并且把由于简并性引起的某些RNA代表性差和RNA数量过多而引起假阳性的现象降到最低程度。•随后又有研究人员对5’端引物进行了改进，随机引物条数改为8条，而且在两端引物上都带上了HindllI酶切位点，使得差异表达片段的克隆变得更加简便5mRNA差异显示技术在动物实验中的应用•栾新红等，利用改进后的银染DD—PCR法筛选小鼠肝脏中差异表达的基因，并进行鉴定，采用BLAST软件对阳性片段进行同源性分析。•结果：经反向Northernblot和测序鉴定后，获得了7条阳性差异表达基因片段(DD—ESTs)，其中有2条DD—ESTs只在游泳疲劳组表达，2条呈现下调表达，另3条呈现上调表达5mRNA差异显示技术在动物实验中的应用•孟元光等应用mRNA差异显示技术，筛选子宫内膜癌的相关基因片段。结果发现自定义的T1.7基因片段在于官内膜癌组织中呈高表达．在增生的子宫内膜组织中呈低表达，在正常子宫内膜组织中不表达。因而得出结论T1．7基因片段可能是子宫内膜癌新的相关基因片段。5mRNA差异显示技术在动物实验中的应用•利用DDRT—PCR对不同生理状态或病理过程中基因表达进行分析，能揭示生理活动或病理过程的分子机制：•Li等采用DDRT—PCR技术，发现梅山猪甲状腺激素β亚基过量表达，分析推测认为，β亚基的过量表达很可能是梅山猪比白猪合成系早达到性成熟的原因；严云勤等发现猪肾皮质中表皮生长因子(EGF)mRNA活性很高，而髓质中却无EGFmRNA活性。•参考文献•[1]张小芳，金梅。DDRT-PCR技术研究进展[J].安徽农学通报,29-30•[2]王秀利，李长绿，刘娣.mRNA差异显示技术的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2007年第•11期;18-20•[3]吴敏生,王守才,戴景瑞.差异显示技术(DD-PCR)及其应用[J]植物生理学通讯1999年•第35卷第4期•[4]金谷，罗光彬,陶金程,牛京京.mRNA差异显示技术概述[J].饲料博览•技术版,2010,•第7期,14-17•[5]王秀利,李长绿,刘娣.mRNA差异显示技术的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2007年,第11•期18-20•[6]吴敏生,王守才,戴景瑞.差异显示技术(DD-PCR)及其应用[J].植物生理学通讯,1999,•第35卷,第4期•[7]金谷，罗光彬，陶金程，牛京京.mRNA差异显示技市概述[J].饲料博览•技术•版.2010年,第7期14-17•[8]蒋单懿.mRNA差异显示技术的研究进展[J].江苏教育学院学报(自然科学版)2006,9,•第23卷,第3期,41-44•[9]栾新红，胡仲明，刘维全，江禹，柳巨雄，王凯.银染DD-PCR法筛选游泳疲劳小•鼠肝脏中差异表达基因的初步研究[J].中国应用生理学杂志.296-298•[10]孟元光,魏丽惠,李春海等.应用mRNA差异显示技术筛选子宫内膜癌相关基因片段•[J].中华妇产科杂志,2001,6,第36卷,第6期;364-368•[11]严云勤，张黎霞，谭景和.猪肾脏中表皮生长因子mRNA活性的研究[J]．解剖学•报．1999，30(2)：176—177．