海洋微藻作为生物柴油生产的新型资源研究

海洋微藻作为生物柴油生产的新型资源研究生物三组：欧安平、陶光吉、吴学民、潘剑洪指导老师：黄勤妮1、绪论•生物柴油是一种发展潜力巨大的可再生能源，海洋微藻作为其原料生物具有资源丰富和产油量高等明显优势。本项目分离筛选到了13种海洋硅藻，对这些硅藻和另2种微藻的生长、总脂含量及脂肪酸进行了测定分析，发现硅藻的脂含量（占干重%）普遍较高，最高为三角褐指藻（36.2%）.以高产生物油为目标，最终筛选获得了生长快、总脂与饱和脂肪酸含量高、资源易得的4种赤潮硅藻（三角褐指藻、假微型海链藻、旋链角毛藻、热带骨条藻），它们是生物柴油生产的理想生物。三角褐指藻的热解产油试验得到了34.2%（占干重比例）的产油率，证实了利用海洋微藻生产生物油燃料的可行性及把赤潮硅藻化废为宝的优势，有明显的经济和社会价值与应用前景。2.1主要仪器与试剂•光照培养箱(宁波赛福PXX-280B)，旋转蒸发器(R206)，超声波细胞破碎仪(JY92-II),显微镜（OlympusBH-2），紫外分光光度计（UNICAMUV300），气相色谱仪(VARIANCP3800)•氯仿、甲醇均用分析纯。2.2样品采集与藻种分离筛选•1.采样地点：主要采样地点包括厦门港、东山鲍鱼养殖区、舟山群岛水域、香港水域，除厦门港为自己取样外，其余样品均委托厦门大学生命学院硅藻实验室协助采集。•2.采集方法：样品采集包括采水和拖网两种。•3.分离方法：采用微细吸管分离法进行藻株分离。2.3藻类培养与样品处理•实验前，在500ml锥形瓶(每个藻种取三个重复样)中进行藻种的扩大培养，在光照5000lx，12h:12h下，用f/2培养液，20℃培养，在微藻指数生长期末期时进行收获。用Whatman玻璃纤维滤膜过滤收集藻泥，冷冻干燥，称重，于4℃中保存待用。2.4藻类生长测定•从藻类扩大培养的第一天起至收集过滤藻液，每天或隔天取一部分藻液用紫外分光光度计测其OD值，以判断藻类的生长状况，并取实验结束时的藻液用鲁哥氏液固定，细胞计数时取0.1ml于浮游植物计数框在显微镜下进行，并计算藻细胞密度与OD值的比率，以确定生长期间藻细胞密度的变化。2.5总脂测定•采用氯仿－甲醇(CHCL3-CH3OH)提取法。将冻干的滤膜剪成小片，分几次加入氯仿-甲醇(1:2)混合液振荡提取脂肪直至滤膜上藻体颜色变白，在所得氯仿－甲醇抽提液中加入蒸馏水使溶液最终比例为氯仿－甲醇－水（8:4:3）[10]。溶液分层后，取氯仿层即下层液体，倒入已知重量的旋转瓶中，用旋转蒸发器旋转蒸干，测出旋转瓶中剩余物质重量即为总脂重量。2.6脂肪酸测定•脂肪酸的提取参考Lepage（1984）的方法略加修改[11]。将冻存的200mg带膜藻粉放入带盖的螺口试管①中，加入4mlCHCL3-CH3OH混合液（V/V=2：1），充N2一分钟后密闭封口；用超声波细胞破碎仪萃取30分钟（温度低于40℃，萃取时间分两次进行，间隔时间萃取液置于－20℃）；往带螺旋帽的水解管②加入0.3ml的内标溶液（0.2mg/ml），用N2吹干后，倒入螺口试管①萃取液，摇匀反应，接着用N2浓缩吹干后，加入2mol/LHCL-CH3OH溶液，充N2后密闭于100℃水浴中反应40分钟；冷却后用2ml正己烷分两次提取，合并提取液（正己烷层）于具塞离心管中，用N2吹至100µl左右，在气相色谱仪上进行脂肪酸测定。2.7热解产油实验•把藻类接种于多个10升的三角瓶中扩大培养，同2.3的方法和条件进行培养与样品收集、处理。取获得的藻粉在流化床反应器上进行快速热解，温度450℃，收集获得的热解液化产物和固体焦炭，分别称重，并计算产油率。3、实验结果3.1藻种分离筛选3.2不同藻类的生长生长相对较快的藻种为三角褐指藻、自养小球藻、牟氏角毛藻、假微型海链藻和新月菱形藻。不同藻种生长期间的OD值及其藻密度/OD比值中文学名天数终藻密度（x103个·ml-1)藻密度/OD比值1234567三角褐指藻0.0240.0550.1120.2880.3470.4070.4351536.43529250细弱海链藻0.0030.0180.0200.0340.0580.0630.08978.1881199威氏海链藻—0.035—0.101—0.128—128.81008877假微型海链藻—0.013—0.201—0.264—995.33765446圆海链藻—0.025—0.094—0.117—305.12614860牟氏角毛藻0.0170.0160.0300.0820.1620.3430.371650.01752022旋链角毛藻—0.009—0.037—0.060—9.5159000扭曲小环藻—0.079—0.187—0.212—297.01400943新月菱形藻—0.054—0.189—0.237—224.3947886尖细拟菱形藻—0.008—0.087—0.108—319.32956787多枝舟形藻0.0050.0130.0190.0610.1160.1640.2001308.86533111血色紫球藻—0.009—0.050—0.084—215.02549407自养小球藻0.0270.0430.0580.1360.2060.3420.3851479.038382353.3不同微藻细胞内的总脂含量和产量01020304050123456789101112131415藻株序号总脂含量/（%干重)050100150200250总脂产量/mg·L-1总脂含量总脂产量总脂含量最高的藻株有三角褐指藻、血色紫球藻、尖细拟菱形藻，它们的总脂含量在30％以上；其次为假微型海链藻，扭曲小环藻，热带骨条藻和旋链角毛藻，总脂含量在20～30％之间，再其次为细弱海链藻，牟氏角毛藻，威氏海链藻，新月菱形藻，总脂含量在10～20％之间；含量最低的为自养小球藻，多枝舟形藻和圆海链藻，均在10%以下。总脂产量的结果则略为不同，产量最高的是牟氏角毛藻、三角褐指藻，其次为自养小球藻、多枝舟形藻、细弱海链藻、新月菱形藻，它们的产量均在100mg.L-1以上。而单个藻细胞的总脂含量较高的藻类为旋链角毛藻、细弱海链藻，其次为威氏海链藻、新月菱形藻。3.4不同微藻细胞内的脂肪酸组成01234567891057455455135511559519518517056125631533548511111612株系号PUFA占干重含量百分比/%PUFA含量(%干重)多不饱和脂肪酸（PUFA）占总脂肪酸的百分含量依次为旋链角毛藻威氏海链藻圆海链藻细弱海链藻假微型海链藻多枝舟形藻三角褐指藻热带骨条藻自养小球藻牟氏角毛藻新月菱形藻小环藻血色紫球藻尖细拟菱形藻.PUFA含量较低的旋链角毛藻、威氏海链藻、圆海链藻、细弱海链藻、假微型海链藻都是较好的生物柴油的材料。3.5热解产油三角褐指藻热解产油结果株系号藻种藻粉重(g)焦碳(g)产油量(g)产油率(%干重)MMDL574三角褐指藻1.7680.9830.60534.2实验结果表明，通过热解方法可以从硅藻中获得较高的产油率，产油量占干重的比例为34.2%，这一结果证实了利用微藻作为生物油燃料生产的资源生物的可行性。4．讨论4.1高脂微藻株系的筛选及其生产生物柴油的潜力分析•从生物柴油的燃烧特性；从生物柴油的工业应用上来考虑；培养周期等综合考虑，我们从本课题获得的十五种微藻中筛选出较适合作为生物柴油生产原料的四种硅藻，它们是三角褐指藻、假微型海链藻、旋链角毛藻、热带骨条藻。三角褐指藻是重要的养殖用的饵料硅藻，而后面三种硅藻是常见赤潮硅藻，因此选择它们作为生物柴油生产的资源生物除了其本身的高油产量潜力的优势外，还有资源易获得的优势。4.2脂肪和脂肪酸含量与藻种的关系•硅藻与其它藻类相比，具有较高的脂含量以及饱和脂肪酸含量，是微藻中作为生物柴油的首选原料。4.3高脂微藻作为生物柴油生产的优势与应用前景分析以藻类作为原料的生物柴油具有如下明显的优点：•占地球表面积71%的自然水体（海洋、湖泊等）每年能提供非常丰富的藻类生物量；•藻类容易繁殖，生长周期短，光合作用效率高，再生生物量每天都可以获得；•藻类的生长繁殖是在水域(淡水或海水)中，具有不依靠土壤特性，不占用农业用地因此热转化的原料生产不影响农业生产，这对于有十多亿人口我国来说尤为重要，而且其养殖过程可以实现自动化控制；•藻类是一种单细胞生物，它没有叶、茎、根。即没有无用生物量，整个藻体都可用于热转化；•藻类含有较高的脂类、可溶性多糖和蛋白质等易热解的化学组分，而其热转化得到的生物能的质量与藻体内的蛋白质等物质含量和质量有关，因此在单位面积和单位时间内藻类可比其它植物热转化产生更高质量的生物能；•藻类不含纤维素等难分解成分，易被粉碎和干燥，所需热解条件相对较低，可使生产成本降低；•藻类可塑性大，可以通过改变培养条件或诱导，提高其产油能力；•从藻类获取的油是没有污染、可再生的能量资源，它的应用不需要改变汽车、飞机的发动机，不需要改变能源的分配方式以及能源资源的市场[15]。•藻类热解所获得的生物质燃油热值高，平均高达33MJ/kg，是木材或农作物秸秆的1.6倍[9]。4.4．筛选高生物柴油产量微藻的新途径•除了从自然界中大量已知的藻株中筛选出高产脂肪的微藻外，我们还可以通过其它途径来提高微藻的产油量。•4.4.1培养条件。对3种海冰硅藻的研究表明,随着温度和光强下降，脂肪含量升高。•4.4.2人工诱变。可以采用人工诱变的方法使微藻细胞内的脂类大量累积。•4.4.3异养培养。可通过异养培养提高微藻的产脂量。•4.4.4基因改造。利用基因工程的方法，从分子水平改变细胞遗传信息，调控细胞内合成代谢途径，促使细胞内脂肪合成累积。•4.4.5直接提高制备生物油燃料的效率。采用热解方法可将藻体细胞转化为液体燃料，微藻的热解可得到芳烃含量高、具有高辛烷值的生物油，同时热解产生的燃料具有能量密度高、易于储运和氮、硫含量低等优点[21]。液化热解法所采用的温度低,耗能少。5、展望与体会5.1生物油燃料作为后续能源的优势和发展前景•作为石化柴油的替代能源，生物柴油是一种清洁的可再生能源，它的利用不会造成大气中CO2增加，也不会排放导致酸雨的二氧化硫，是优质的石化柴油代用品，典型的“绿色能源”。大力发展生物柴油对经济可持续发展，推进能源替代，减轻环境压力，控制城市大气污染具有重要的战略意义[23]。因此，生物柴油具有极大的利用潜力。5.2微藻在生物油燃料开发中的巨大潜力•在众多的生物中，微藻具有脂类含量高、资源丰富、生物量大、生长周期短、易培养等优点，使其通过热解获得的生物质燃油或通过酯化反应获得的生物柴油具有热值高、废气少、易储运等优点，因此微藻是重要的可再生生物能源。•微藻可用于提取活性物质、作为海洋保健品和药物的资源生物，同时也可用于污水处理。因此，以微藻为原料生产生物柴油具有很好的发展前景。•海洋微藻资源丰富，通过大量的分离筛选和研究，可以获得高脂产量的微藻。因此，从海洋微藻筛选生物柴油生产的目标微藻潜力巨大。5.3利用藻类赤潮获取大量的生物柴油原料•本项目筛选到的4种高产生物柴油的硅藻均为常见赤潮硅藻,不仅可以人工培养,也可以利用赤潮爆发时获取大量的藻物质,达到生产生物柴油和治理赤潮危害、化废为宝的双重目的。5.4本项目的创新之处及后续工作•我们的后续工作主要包括以下几个方面：进一步对筛选到的高脂微藻种类进行油脂提取和酯化反应工作，制备高质量和高产量的生物柴油；进一步扩大藻种资源，筛选更多的海洋微藻种类作为生物柴油生产的资源生物；通过实验探讨提高微藻的油产量的各种方法，如优化培养条件、人工诱变、基因工程改造、异养培养等。6、结论•本实验通过有目标的微藻藻种分离筛选，获得了十五株不同种类的微藻，发现不同微藻在生长、总脂含量和产量、脂肪酸组成和含量等方面有明显的差异，从生物柴油生产的需要出发，从中筛选到了总脂含量高、不饱和脂肪酸含量低、生长快、原料易于获得的4个藻种（三角褐指藻、假微型海链藻、旋链角毛藻、热带骨条藻），并利用三角褐指藻获得了3