DGGE技术及其在微生物研究中的应用

1变性梯度凝胶电泳--DGGE摘要：变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术具有精确、快速、易操作等特点,能克服传统微生物研究方法的不足，作为一种分析微生物群落的有效工具被广泛的应用于现代微生物研究。本文介绍了DGGE技术的原理、操作步骤及应用情况，并讨论了其缺点及应用前景。关键词：DGGE分子生物学微生物群落菌群分析1引言变性梯度凝胶电泳（Denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）技术是由Fischer和Lerman[1]于1979年首先提出了,并将其用于医学上基因点突变的检测。与传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比,这项技术可以分辨只有一个碱基差异的基因序列。1985年,MyersRM[2]等人首次在DGGE中使用“GC夹板”和异源双链技术,使该技术日臻完善。1993年，Muyzers[3]等人首先将PCR技术与DGGE结合，在微生物生态学领域首次采用PCR-DGGE方法分析检验rRNA的基因,证实了该技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和菌群差异方面具有独特的优越性。此后的十几年内DGGE技术在研究微生物多样性和种群差异上已成为一种重要工具,并被广泛用于活性污泥、池塘底泥、污染土壤、海洋、冰川等环境样品以及食品、动物肠道中的微生物多样性检测和种群演替的研究。2基本原理PCR-DGGE技术主要是先利用特定的引物合成一定长度的rRNA的基因序列，然后利用梯度变性胶来分离DNA片段。梯度变性胶是在一定的浓度聚丙烯酰胺凝胶中添加不同浓度的变性剂，使变性剂形成由低到高的线性梯度。电泳时，DNA在胶中的迁移速率仅与其分子大小有关，当DNA到达具有一定浓度变性剂时，DNA双链开始解链，迁移速率开始降低。当DNA双链完全分开时，其电泳速率急速下降。由于不同的DNA片段碱基组成存在差异，其变性条件也有所不同，在凝胶上会停留在不同的位置，经染色后形成不同条带。理论认为,只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、温度等足够精细,有一个碱基差异的2DNA片段都可被分开，在不同泳道中停留在相同位置的条带,一般可视为具有相同的DNA序列。为了使仅有一个碱基之差的不同分子取得最好的分离效果,须先选择所研究的DNA范围及电泳过程中所需的变性剂浓度梯度。由于DNA解链温度的升高时迁移速率的变化不明显，难以将野生型和突变型DNA分开，所以高温解链区的突变往往难以检测[11]。而且，高温解链区的解链时间较长，也限制了DGGE的使用。解决的办法是在DNA片段上连接一段长度为30~50bp富含GC的核苷酸序列,该序列被称为GC夹板(GC-clamp)。在DGGE分析过程中形成一个人工高温解链区，使DNA片段的其他部分处于相对的低温解链区，从而易于分析。3技术步骤：(1)样品总DNA提取(2)样品16SrDNA片段的PCR扩增(3)DGGE条件优化与分析(4)割胶测序等后续分析。3.1样品总DNA提取群落总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础，样品中细菌种类复杂且混杂有大量有毒物质,如何使所有细胞裂解、充分释放DNA、有效去除杂质,建立高效、可靠的DNA提取方法成为研究者关注的热点。当前主要使用超声波法、基于SDS的裂解法、改进的化学裂解法、微波法、冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS和DNA试剂盒法等6种DNA提取方法。3.2样品16SrDNA片段的PCR扩增PCR扩增是PCR-DGGE技术中至关重要的步骤。PCR全过程包括三个基本步骤:变性、退火、延伸。反复进行变性、复性和延伸的循环,从而使扩增DNA产量呈指数上升,经25~30个循环后,扩增倍数可达106倍。在多重PCR中很容易产生PCR偏差和PCR假阳性,这样就不能真实客观地反映微生物群落的多样性,甚至显示实际上并不存在的微生物信息。下面就简要介绍一下常见的PCR偏差和PCR假阳性及其排除方法。由引物与模板的退火温度引起的PCR偏差。在多重横板PCR中,引物不可能与所有的模板序列都完全互补,两者之间会有一个或几个碱基的错配,大大降低了这类模板的扩增效率,这样就会产生严重的PCR偏差。排除这种PCR偏差的方法是适当降低退火温度或使用简并引物。在PCR最终产物中,不同序列浓度趋于31B1,掩盖了模板起始浓度的差异。这是由于起始浓度低的模板经扩增后其PCR产物又作为模板继续扩增,且在PCR的最后几个循环其扩增效率高于PCR产物更为丰富的其他序列,使最终产物浓度趋于1B1。排除这种PCR偏差的方法是减少PCR循环数,提高从变性温度到退火温度的降温速率。异源DNA序列的产生。这是由于随着PCR扩增循环数的增加,产物浓度逐渐增高,引物逐渐减少,异源单链DNA分子退火的可能性大大增加,从而产生异源DNA分子。在DGGE电泳中,就会产生多余的条带,得出错误的关于微生物群落多样性的结论。排除这种PCR偏差的方法是减少PCR循环数,或是将PCR产物稀释后,再作为模板进行PCR扩增。由于16SrDNA具有以下几个特点:(1)序列长短适中,适合用作分类学上的研究。(2)16SrDNA在任何一种原核生物体的普遍存在性;。(3)极端保守性。(4)16SrDNA无法在不同的个体间进行基因交换,各物种具自己的独特序列。(5)目前已有相当完备的16SrDNA基因资料库,经过GenBank和RibosomalDatabaseProject(RDP)基因资料库作对比分析，并可进行亲源关系分析、鉴定等。通常采用16SrDNA中的保守区作为引物进行PCR反应。16SrDNA不同可变区V1、V3、V5、V6、V8及V1~V3、V3~V5、V6~V8区的PCR扩增产物及其DGGE结果。结果表明扩增V3区及V3~V5区的引物为最佳引物选择。V3区的PCR-DGGE条带数最多、分离效果最好。如果需要较长的扩增产物,则选择V3~V5区。3.3DGGE条件的优化电泳条件的选择在整个分析过程中具有至关重要的作用，直接关系到条带分离的效果，影响后续分析。如果条件不当，会发生单一的DGGE条带可能含有不止一种序列的条带共迁移现象[13]。DGGE电泳条件选择包括凝胶浓度、变性剂梯度、温度和电泳时间的确定。通常根据基因片段的大小来确定聚丙烯酰胺凝胶浓度,当片段大小在200bp左右时,一般采用8%的凝胶,片段在500bp时用6%的凝胶。为提高分辨效果,也可以采用梯度凝胶进行分离,对于200bp的片段,可以采用6%~12%的丙烯酰胺凝胶[12]。变性剂的梯度范围要根据垂直DGGE实验来确定。在垂直变性梯度实验中,DNA分子的运动方向与变性剂梯度线性增加方向垂直。电泳完成后用EB染色,DNA片段经凝胶成像系统呈现出一条清晰的/S0型曲线[6]。垂直实验曲线斜率较大的部分代表解链区域的Tm值,此时低温解链区的不同分子达到最佳分离状4态。通常选择水平胶的变性剂梯度范围为30%(相当于Tm范围10°C左右),对于不同的样品还需要进行调整。对大多数DNA片段50°C~65°C是比较适合的,通常电泳的温度要低于样品解链区域的Tm值。电泳时间取决于样品的片段大小、凝胶浓度、变性剂梯度、电泳时的电压等因素,一个条件的改变都可能引起电泳时间的不同,可以用时间进程法来优化出最佳电泳时间。为了更好的显示DGGE条带,可以选择不同的染色方式(EB、SYBRGreenI和银染)。其中,SYBRGreenⅠ染色的优点是背景色低,可以观察到尽可能多的条带;银染的灵敏度最高,但银染过后的条带不能用于杂交分析[12]。3.4后续分析对DGGE图谱上的优势条带进行割胶回收,将回收条带的PCR产物进行测序分析，分析指标有：多样性参数和相似性指数。DGGE条带通过Smart-view软件检测峰面积。微生物群落多样性指数用Shannon-Weaver指数(H)表示。Shannon多样性指数H通常用于评价一个微生物种群内物种的丰富性,H值越高,表明微生物种群越丰富。多样性指数通常由2个因素构成:(1)样品中物种的数量或称为种的丰富度。(2)各个物种量的分布或称为种的均匀度。因此,H值可反映种群内及种群之间的遗传多样性分布和差异,其表达式为:式中,ni表示第i个条带的峰高值,N表示密度曲线中所有峰高之和。根据软件分析获得DGGE的条带配对图,在条带出现的地方定义为1,未出现的地方记为0,这样就得到DGGE条带配对的二次矩阵,根据二次矩阵用NTSYSPC(2.10,ExeterSoftware,USA)进行聚类分析[4]。Sorenson'spairwisesimilaritycoefficient(Cs)相似性分析指数,可比较不同样品间及分析菌群的动态变化,计算公式如下:其中Nx为泳道x条带数,Ny为泳道y的条带数,j为2个泳道共有的条带数。Cs值越大,表示两个样品的相似程度越高[9]。4DGGE技术的应用PCR-DGGE技术由于克服了传统微生物必须先经富集才能进行微生物学分析的局限性,可以直接对样品进行处理和分析，省却了人力和时间，因此能够被用来探索海洋、冰川、土壤、污泥等生境中以及食品、动物体内的微生物资源,5因此它在分析微生物多样性和群落动态性等方面得到广泛应用。4.1分析微生物多样性PCR-DGGE图谱可用于确定环境微生物群落中优势类群或独特种群的遗传多样性,在某些情况下为了得到更详细的信息,可通过DGGE指纹与分类单元特定的寡核苷酸探针杂交或对切下的DGGE条带序列分析来进一步鉴定菌落成员。PCR-DGGE技术与其他分子生物学方法结合,则更能实际准确地揭示微生物群落的结构和功能,指导人们更好地认识自然规律。4.2监测微生物群落动态性PCR-DGGE技术可同时分析多份样品,监测某些生境中微生物群落结构及其在时间或空间上的动态变化,因此,他已成为研究微生物群落动态的一种重要手段。此外,PCR-DGGE技术还有助于发现新的微生物物种。5DGGE技术的局限性及解决方法DGGE技术虽然被广泛使用，但仍存在局限性。第一,利用DGGE分离的PCR产物,一般要求DNA长度在500bp以下,否则DGGE的分辨率会下降,而判断微生物所属的系统类群,要求分析的16SrDNA片段长度至少达到500bp，因此给PCR引物设计和系统发育分析带来一定困难。第二,DGGE指纹通常显示微生物群落中的优势种群,Muyzer等指出此法只能对菌体数量大于总菌量1%的菌群进行分析。第三,每种菌可能含有1~15个数目不等的rRNA基因,这可能导致自然群落中细菌的数量被过多地估计。第四，DGGE的共迁移问题使图谱中单一的条带并不总是代表单一的菌株,或是在不同的泳道中移动到同一位置的条带可能由不同的细菌组成。第五，DGGE技术不能提供在某一生境中微生物群落的真实图景,也无法直接同微生物的生理相结合。第六，DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库,若数据库中基因序列信息不够丰富,将会限制DGGE的使用。对于以上存在的缺陷，除进行系统优化外,还可以从以下两点着手解决:选择合适的目的基因片段。根据研究目的的不同,选择合适的目的基因片段可将微生物鉴定到类、属、种、菌株等不同分类层次。与克隆、测序、核酸杂交、RFLP等技术联用,不仅可以克服单一技术存在的缺陷，对实验结果进行交叉验证，还可以更准确的从不同方面反映环境中微生物多样性信息。66应用前景尽管DGGE技术存在一定的局限性，但其具有可靠、快速、易操作等特点,能克服传统微生物研究方法的不足,重现微生物多样性,提供微生物在时间和空间上的动态变化。另外这种技术存在的缺陷,可以通过其他生物学技术来弥补,如末端标记的荧光PCR和区内标准可以用于检测稀少菌落成员和精确比较样品之间的差异。因此,PCR-DGGE技术与其他生物技术相结合,将能更实际地反映微生物群落的结构、功能和动态变化,提供微生物的空间分布、群落演替、原位生理等信息,促进人们对微生物生态的认识,为微生物资源的开发利用提供理性导。参考文献[1]张宝涛,王立群,伍宁丰,石鹏君.PCR-DGGE技术及其在微生物生态学中的应用[J].生物信息学,2006,03:132-134.[2]MyersRM,F