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Undersameenvironment,ifyouwanttoenhancegenomicstabilityforaspecies,whatdoyoudo?研究背景基因组指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。目前大多数科学家都认为，维持遗传物质基因组稳定性重要因子功能的缺失，可引起基因组出现不稳定性和基因突变。DNA损伤修复是保障基因组稳定性，维持其编码信息不变，并将遗传信息准确无误的传给子代细胞的关键过程。高等生物已经进化出一套由众多的DNA修复因子和细胞周期调控蛋白质构成的基因组稳定性维护体系。研究思路为了研究在相同环境下，如何进一步提高某一物种的基因组稳定性，我们拟选用人类基因组进行研究。通过相关查阅文献得知，目前对于提高基因组稳定性的方法大体可以划分为以下两个方面：1、DNA物理结构的稳定；2、DNA化学结构的稳定。其中，DNA物理结构的稳定主要取决于细胞所处的物理环境，在本研究中由于设定了环境相同，我们默认环境最优，因此不在讨论范围。而DNA的化学结构稳定可以将其细分为：基因组稳定性维持与基因组损伤后修复。由于基因组在复制中受到外界因素影响而突变经常发生，因此基因组损伤后修复对于基因组稳定性有着非常重要的作用。因此本文会以基因组损伤后修复为对象进行讨论。研究方案在复制和重组阶段中要保持基因组稳定性，需要大量不同的损伤应答蛋白参与。细胞决定何时何地配置这类DNA修复组合的能力对基因组稳定性非常关键。前期通过查阅相关文献已知组蛋白脱乙酰酶(HDAC)有各种可在不同生物途径中起作用的底物。Robert等[1]发现蛋白质乙酰化在酵母中可在DNA损伤应答和自噬之间形成重要连接。他们使用HDAC抑制剂发现HDAC活性是DNA双链断裂(DSB)有效修复所必需的。这种敏感性的部分原因是由于在HDAC受到抑制时修复蛋白Sae2的表达水平大幅下降。他们展示了Hda1和Rpd3这两种特定HDAC是Sae2脱乙酰化所必需的。同时阻断细胞自噬可稳定Sae2，使HDAC突变细胞中的DSB修复缺陷得以恢复。因此我们考虑，细胞自噬和HDAC在细胞DNA损伤应答过程中的协调关联关系究竟是什么，希望能够在通过探明两者的调控信号通路的基础上，借助本实验室长期以来合成生物学技术的应用，人为对调控进行干涉，从而促使修复蛋白Sae2的高量表达。具体流程如下：假设存在一种用于启动细胞自噬过程的蛋白A，则该蛋白A由细胞核内基因a编码形成。首先通过敲出a基因后，细胞自噬过程被中断，从而验证蛋白A是细胞自噬过程中的关键蛋白。利用基因敲除技术，制得单独缺失基因a的细胞、单独缺失编码蛋白Hda1和Rpd3的基因hda1/rpd3的细胞。分别将其A-细胞、HDAC-细胞对比野生型细胞，检测其HDAC酶活、细胞自噬蛋白A的表达差异是否有变化；从而确定细胞自噬与HDAC的关系。假设是细胞自噬后所释放的某种蛋白因子调控影响编码HDAC基因的表达，HDAC的表达影响Sae2的表达。由于自噬过程中释放的因子较多，不适合进行正向研究。因此选取编码HDAC基因进行逆向研究。由于已知蛋白HDAC参与到Sae2蛋白的表达调控。首先筛选出与蛋白HDAC相互作用的蛋白。可采用酵母双杂交的方法进行初步筛选，再采用Co-IP进行验证。酵母双杂交筛选流程如下：构建诱饵蛋白（蛋白HDAC）表达载体——自激活检测；cDNA文库——滴度或扩增文库；共转酵母菌；筛选克隆；提取质粒；分类去除质粒；转化大肠杆菌纯化质粒；测序；序列比对；再验证；分析蛋白功能。同时，为了防止假阳性，可对筛选出来的基因进行移码突变。将移码突变后的质粒再进行酵母双杂交实验，不能生长的为阳性克隆，反之为假阳性。通过用Co-IP验证是否存在蛋白间相互作用。将筛选到的文库质粒表达蛋白和诱饵蛋白分别构建到表达载体上，文库蛋白带HA标签，诱饵蛋白带Myc标签。通过共转染使细胞同时表达文库蛋白和诱饵蛋白，再通过Co-IP实验验证蛋白之间的相互作用。通过逆向寻找相应和蛋白HDAC互作的自噬蛋白因子后，通过在大肠杆菌中进行特定基因预测并尝试合成表达，然后将人工表达的该蛋白放入到细胞自噬缺失的细胞中，检测蛋白HDAC酶活差异。经检测确认的人工合成基因，在其前端拼接T7RNA聚合酶启动子片段、末端加载一段T7RNA聚合酶片段，并由IPTG信号诱导表达。同时，对HDAC中显著影响Sae2合成的蛋白Hda1和Rpd3的基因hda1/rpd3，通过合成生物学方法在其前端拼接T7RNA聚合酶片段，使得对整个调控产生了一条新的调控通路即T7表达调控且由于在T7RNA聚合酶前还有一段T7RNA聚合酶启动子，因此会产生T7正反馈机制，从而进一步增强Hda1和Rpd3的表达量。同时，由于野生型T7表达体系可能不完全适应于细胞DNA复制过程中蛋白Hda1和Rpd3的表达，因此可以对T7启动子进行定点突变，从而得到不同启动强度的T7表达系统，方便进行调整更换。整套调控机制如下图：参考文献[1].RobertT,VanoliF,ChioloI,etal.HDACslinktheDNAdamageresponse,processingofdouble-strandbreaksandautophagy[J].Nature,2011,471(7336):74-79.