DNA提取原理

基因组DNA提取原理及方法Time：2009-12-26AM10:54Author:bioerHits:5617times一、原理DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA。DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。苯酚/氯仿作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态，真核细胞DNA的分离通常是在EDTA及SDS一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞获得。诸多生物试剂公司现已有各种类型DNA提取试剂盒出售。二、材料及试剂1.GENTRODNA提取试剂盒2.异丙醇3.70％酒精三、操作步骤（一）、从全血中提取DNA1.溶血：加300ul的肝素或EDTA二钠抗凝的全血到含RBCLysisSolution900ul的1.5mlEP管,室温静置1min,期间，轻轻颠倒混匀10次。13000~16000g离心20s。2.弃上清液，将管底的白色沉淀用枪头吹散，使白细胞在残留的液体中悬浮。3.加300ul的CellLysisSolution于EP管中,充分混匀。4.加100ul的ProteinPrecipitationSolution于EP管中,充分混匀,13000~16000g离心3min.5.取上清液，加300ul的异丙醇，充分混匀颠倒50次，可见白色絮状沉淀，13000~16000g离心1min。6.弃上清液，加入70%的酒精500ul，13000~16000g离心1min。7.弃上清液，加入DNAHydrationSolution50ul,充分混匀，65℃5min使DNA完全溶解。8.紫外分光光度计测定OD260/280，比值大于1.8即可。（二）、从组织中提取DNA9.取液氮冷冻的叶片2-3片，在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。10.将粉末放入到1.5ml离心管中，然后加入缓冲液“S”750ul,充分混匀。11.将离心管置于65℃水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。12.取出离心管,每管加入等体积的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul，混匀后离心，10000rpm,10分钟。13.上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，10000rpm,6分钟。14.将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA,并用70％乙醇冲洗2次。15.勾出的DNA，真空干燥后将其溶于500ul1×TE中。16.加入3ulRNA酶溶液，37℃保温1小时。17.加入等体积的酚-氯仿溶液,轻轻混匀后,10000rpm离心6分钟。18.取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000rpm离心6分钟。19.取上清液，入1/10体积3M醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇（或95％乙醇）。20.轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA,用70％乙醇冲洗2次后，真空干燥。21.依所提DNA量加入20-50ul的1×TE溶解DNA。22.测定DNA的浓度，取少量样品跑电泳,Agarose胶的浓度为0.8%。23.样品在4℃下保存备用。附:提DNA所用试剂配方：1.1.1MTris-Cl(1L：800mlH2O中加121.1gTris,用HCl调pH至8.5后定容至1升，灭菌)2.0.5MEDTApH8(1L:800mlH2O中加186.1gEDTANa22H2O，用NaOH调pH至8.0，定容至1升)3.20%SDS(2L:在2L热水中缓慢加400gSDS，边加边搅拌，溶解后放置热地方保存)4.5MNaCl(1L:750mlH2O中加292.2gNaCl，溶解后定容至1升，灭菌)5.缓冲液“S”：配1L缓冲液“S”1)100mMTris.ClpH8.51MTris.Cl100ml2)100mMNaCl5MNaCl20ml3)50mMEDTApH8.00.5MEDTA100ml4)2%SDS20%SDS100ml5)H2O680ml6.100xTE(1L:800mlH2O中加121.1gTris,37.2EDTANa22H2O,用HCl调pH至8.0,定容，灭菌)7.50xTAE(1L:500mlH2O中加242gTris，溶解后加100ml0.5MEDTApH8.0和57.1ml冰醋酸，定容)8.蛋白酶K溶液的配制(用20mMTris.Cl,pH8,2mMCaCl2的缓冲液配制浓度为10ug/ul的蛋白酶K溶液；或用超纯水配制成相同的浓度)9.RNase(用水溶解RNase,终浓度10mg/ml,煮沸20分钟，缓慢冷却，分装，-20℃下保存)10.10.3MNaAcpH5.2(1L:600mlH2O中加入408.24gNaAc3H2O,溶解后，用冰醋酸调pH至5.2，然后定容1L，灭菌)四、注意事项不同要求时可选择不同抽提方法提取DNA