DNA提取和PCR技术

DNA提取和PCR技术一.DNA提取一).实验目的掌握DNA提取的方法二).实验器材①LB液体培养液②酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸处理，市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色，需要重蒸二次，收集沸点160℃部分，小瓶分装，瓶内空腔充氮气，－20℃密封保存，以免氧化，用前从冰箱中取出，68℃蒸馏水饱和，加入8—羟基喹啉（100g酚加0.1g），酚变为黄色。8—羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含8—羟基喹啉的酚用等体积1.0mol/LpH8.0Tris缓冲液抽提，再用0.1mol/LpH8.0含0.2％β－巯基乙醇的Tris缓冲液抽提数次，酚溶液的pH应大于7.6。此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存一个月，纯化和制备酚溶液都要带手套，以免损伤皮肤。③核糖核酸酶：无DNA酶污染，将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris－Cl(pH7.5)15mmol/LNacl溶液中，浓度为10mg/ml.于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装后于－20℃保存。④TEG缓冲液：pH8.025mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA,50mmol/L葡萄糖,4mg/mL溶菌酶⑤标准菌株：大肠埃希氏菌⑥碱裂解液：0.2mol/LNaOH,1%SDS⑦乙酸钾溶液、乙酸钠溶液、溶菌酶溶液、丙酮溶液。三).实验内容1)将大肠杆菌接种于LB培养基在37°C环境下，以150r/min震荡过夜培养。2)取1ml对数期菌液，12000rpm5min；3)弃上清，将沉淀溶于200ul丙酮，震荡混匀，冰浴5min。4)8000rpm离心2min，弃上清。5)将沉淀混于TEG缓冲液中，震荡混匀，冰浴5min6)加入200ulSDS裂解液，冰浴5min7)加入150ul乙酸钾溶液，冰浴15min，使其沉淀完全。8)4°C下离心，12000rpm，5min。若上清液浑浊，应混匀后再冷至0°C，重复离心。弃去上清9)加入等体积的酚-氯仿饱和溶液，反复震荡，离心，12000rpm2min10)将上清移至新管，加入2倍体积预冷无水乙醇，混合摇匀。11)-20C，15min后，4°C下离心12000rpm5min。12)1ml70%冷乙醇洗涤沉淀，然后离心，弃去上清液。13)干燥，100ul20ug/mlRNaseA，37C，30min14)2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤(沉淀DNA可以使用一倍体积异丙醇或2倍体积乙醇。)倍体积乙醇。15)干燥，溶于50ulTE四).实验原理基因工程实验所需要的基因组DNA通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA非易事。对于细菌来说，细菌细胞具有坚硬的细胞壁。提取难度将大于真核细胞。细菌基因组DNA在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，如果要抽提到大的DNA分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。另外制备的DNA必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。DNA不溶于95%的酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。并且用酒精可以洗脱在前几步实验中使DNA携带的盐离子。对于细菌而言，有染色体DNA和质粒DNA，因此要将其分离开。处理过程中，细菌染色体DNA缠绕在细胞膜碎片上，离心时容易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，上清液中还可能有蛋白质，核糖核蛋白和少量的染色体DNA。大肠杆菌染色体DNA抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞，SDS具有的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3）SDS能与蛋白质结合成为R1—0—SO3R2—蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS也能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。以免影响下一步RNase的作用。破细胞后RNA经RNase消化除去，蛋白质经苯酚、氯仿—异戊醇抽提除去。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，回收DNA。此种方法抽提的细菌染色体DNA，RNA和蛋白质污染，无可用于限制性内切酶消化，分子再克隆等。但在下一步实验前，要测定其DNA的浓度，常用测定DNA浓度的方法，是溴化乙锭电泳法；当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB会增强发射的荧光。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待样品的浓度。本实验利用的就是使用裂解液（含去污剂SDS）将细胞壁破坏，裂解后，用乙醇将DNA沉淀下来。五).注意事项1.提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑）以免枪头损伤DNA。2.菌量有一定的要求，通常为菌液的OD600=1.9时，取1-2ml就可以了。3.裂解步骤中，如果不澄清说明菌体没有裂解，可能的原因有：a。菌量太大；b。该菌为厚壁的非革兰氏阴性菌。4.沉淀DNA可以使用一倍体积异丙醇或2倍体积乙醇。5.加洗液RnaseA，量要加足，以防止清洗不净影响未来的2.最好是风干。6.沉淀DNA可以使用一倍体积异丙醇或2倍体积乙醇。7.加洗液RnaseA，量要加足，以防止清洗不净影响未来的实验。8.要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。二、PCR技术一).实验目的掌握PCR反应的基本原理和实验技术二).实验原理PCR是聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）的英文缩写，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。PCR反应基本步骤：1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70~72℃，30~60s）重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟，2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。三).实验步骤1.按下列顺序将PCR反应体系各成分在一只无菌的标准0.5mL新Ep管内混匀：10×Tap缓冲液2.5μLdNTP混合物1μL（各2.5mmol）引物1（上游引物）1μL（0.5μmol）引物2（下游引物）1μL（0.5μmol）模板DNA约10ng（质粒），约1μg（基因组DNA）TapDNA聚合酶1μL（2.5μ/μL）去离子水加至25μL用手指头轻弹管壁数次，混匀后高速离心5s，使反应液集中在管底，再加1~2滴矿物油封住溶液表面，防止样品蒸发。2.打开电源开关，按PCR仪操作说明设定运行程序，使PCR仪进入预热状态。3.PCR反应（在PCR仪上进行）待PCR仪预热后将上述反应混合液连同Ep管置于PCR仪95℃池中加热5min，使DNA完全变性。按以下设置完成25~35个循环。95℃1min变性50℃2min复性72℃2min延伸循环结束后，72℃延伸10min。置4℃保存至电泳检测。4.电泳检测结果将PCR扩增的产物用0.7％~1.0％的琼脂糖凝胶电泳检查，用DNAmarker作相对分子质量指示。以能看到片段大小、条带清晰的结果为最佳。四).PCR技术应用1.分子生物学的理论研究运用PCR方法可进行DNA序列的分析，尤其对特殊序列的DNA，如AT丰富区，GC丰富区。长的卡夹结构等的分析，还可以进行核苷酸的定点突变，测定染色体上两个位点之间的重组值，制备高标记的DNA探针等理论研究。2.临床医学上的研究可检测由基因的缺失、转位、单基因的点突变或者由于某种致病基因的存在（如遗传或病毒感染等）所引起的各种疾病。3.法医学和刑事侦破上的应用应用聚合酶链式反应可以从罪犯的一根头发或一滴血斑中获得有关罪犯的基因类型的证据。也可以进行亲子鉴定